体外血脑屏障模型的研究进展及其在新药研发中的作用

王伯松 郭安臣 王 群

（1 哈尔滨商业大学生命科学与环境科学研究中心，黑龙江 哈尔滨 150076；2 北京脑重大疾病研究院，北京 100069；3 首都医科大学附属北京天坛医院，北京 100050；3 国家神经系统疾病临床医学研究中心，北京 100076；5 脑血管病转化医学北京市重点实验室，北京 100076）

血脑屏障（brain-blood barrier，BBB）是脑毛细血管阻止某些物质（多半是有害的）进入脑循环血，从而保持脑组织内环境的基本稳定的一种基本结构。从生物学和功能角度来看，BBB在维持脑内稳态方面起着至关重要的作用，因为BBB功能的恶化会诱发或加重中枢神经系统疾病。相反，BBB阻碍有害物质的同时也阻碍了治疗大脑内多种神经疾病的靶向药物。本文即通过血脑屏障模型建立的研究进行综述。

1 血脑屏障的结构

血脑屏障（BBB）是中枢神经系统正常功能所必需的扩散屏障。BBB的内皮细胞与身体其他部位的内皮细胞不同，他们的细胞质厚度均匀，没有开窗而且具有更广泛的紧密连接（TJs）以及少量的吞饮囊泡。内皮细胞紧密连接限制亲水分子穿过BBB的细胞旁通路。相反，小的亲脂性物质，如O2和CO2则可以沿着它们的浓度梯度通过自由扩散穿过质膜进入脑实质内[1-2]。葡萄糖、氨基酸等营养素通过转基因蛋白进入大脑，而像胰岛素、瘦素和铁转铁蛋白等更大分子的摄取则通过受体介导的内吞作用[3-5]。除了内皮细胞以外，BBB的组成成分还包括毛细血管基底膜（BM），星形胶质细胞的末端，足细胞以及包埋在BM内的周细胞（PC）组成。基底层由血管周围的星形胶质细胞产生，它具有包括细胞黏附和迁移的机械支持，以及跨细胞受体（整联蛋白）建立连接细胞的细胞骨架元素到细胞外基质（ECM）桥梁的功能[6]。这层基底层还调节细胞之间的沟通，是血管系统和大脑之间的另一个大分子障碍通道[7]。周细胞是BBB结构中细胞成分最少的部分，但在血管结构完整性及分化，和内皮紧密连接的形成中起至关重要的作用[8]。由此看来，BBB的所有组成成分对于BBB正常功能和稳定性都是必不可少的。

2 血脑屏障模型的建立

2.1 利用Transwell建立体外BBB模型：这是最简单可行也是最常见的体外BBB模型。在静态系统培养条件下，将单层脑毛细血管内皮细胞EC接种在可渗透的支架上。在Transwell小室中，将允许溶质通过的微孔半渗透的支架置于细胞生长培养基中，再将细胞接种在支架底部，使其在渗透膜之间通过[9-10]。这种BBB模型允许内皮细胞进行迁移。已经有大量的动物以及人的脑血管EC用于建立血脑屏障体外模型。虽然这种模型比较稳定，成本也比较低，但是缺乏相邻细胞群之间的信号传导，如星形胶质细胞以及周细胞，和机械性刺激的致敏性调节，如剪切应力。这就很大限度的限制了长期维持BBB模型特性的能力[11]。

因此在这个模型的基础上建立了更加复杂的共培养系统来进一步完善BBB模型。其中被使用最广泛的就是星形胶质细胞与脑血管内皮细胞的共培养系统，因为星形胶质细胞在血脑屏障细胞群紧密发展中起至关重要的作用。最常见的方法之一，是将ECs接种在微孔滤膜的上层，而将星形胶质细胞接种在下层，虽然这样可以使两种细胞直接接触，但是高于体内的厚度使细胞间的作用力受到了限制。另一种方法是将星形胶质细胞在容器底部培养，使释放的因子通过扩散透过滤膜与内皮细胞相接触。还有一种方法是将神经元，星形胶质细胞与周细胞三种细胞群共培养的BBB模型。将ECs接种在微孔滤膜的上层，下层接种星形胶质细胞，在容器底部接种神经元。也有研究将星形胶质细胞和周细胞混合接种在容器底部来进行试验[12]。这种添入神经元的共培养系统所形成的BBB模型，在某种程度上可以对药物治疗中枢神经系统的影响进行评估。但由于共培养系统所形成的环境较为复杂，使得可管理性大大降低。

2.2 永生化内皮细胞系建立BBB模型：目前许多研究开发了不同来源的永生化内皮细胞系，但却只有少数能够表达BBB在体内的功能和特性。在最近的研究中，Rahman等[13]共统计了36种利用永生化内皮细胞所建立的BBB模型。其中人脑微血管内皮细胞系hCMEC/D3，大鼠脑血管内皮细胞系RBE4和小鼠脑微血管内皮细胞系bEnd.3是被用来建模次数最多的三种细胞系。这种细胞系建立的模型能够有效地体现较多BBB的EC特性，使得体外的BBB模型更具有人的特性。这个细胞系能够保持体内的内皮表型，包括许多受体以及转运蛋白，直至几十代[14-15]。在使用该细胞系的时候，可以通过将其与周细胞或是星形胶质细胞共培养的方式来改善BBB屏障的紧密度[16]。

大鼠脑血管内皮细胞系RBE4在BBB建模中表现出较好的特性，但其缺乏形成TJ的复合物，导致细胞旁通透性较高，限制了其在CNS药物分布检测中的应用。小鼠脑微血管内皮细胞系bEnd.3和bEnd.5在商业的利用比较广泛，其中细胞系bEnd.3的模型由于TJ蛋白水解蛋白-5，闭合蛋白以及紧密连接蛋白ZO-1的高水平表达表现出比bEnd.5更加紧密的屏障[17]。bEnd.3细胞系细胞生长速度快，低细胞旁通透性以及可以保留数代的内皮表型，使其建立的BBB模型更具开发性[17]。

2.3 通过3D细胞外基质（ECM）建立BBB模型：通过使用一种细胞外基质（ECM）与同质的细胞群，如星形胶质细胞、周细胞及微血脑管所共组建的2D培养物已经被广泛应用。但是这种2D培养物所建立的BBB模型只能将细胞培养限制在平面环境中。而最近几年出现了三维球体、三维水凝胶以及ECM和固体支架所建立的3D培养模型[18-19]。其中Chrobak等[20]就是通过建立这种三维细胞培养的方法来产生微血管，以此来研究内皮细胞和上皮生理学。他们使胶原凝胶形成一个圆柱形通道，在其中融合了人的单层ECs，再将血管周细胞加入其中，也可以等到EC细胞生长到可融合后加入。但是这个模型缺乏剪切应力以及因为扩散等因素所造成的外部刺激。

Ⅰ型胶原通常被选作为细胞外基质来建立体外模型。胶原蛋白作为从各种生物资源中分离出来的天然水凝胶，它不但可以与整联蛋白受体相互作用来调节基因表达外，还可以支持三维细胞的生长与分化[21]。目前已经有许多研究将其应用于细胞增殖、细胞迁移、炎症作用以及药物毒性和肿瘤细胞的侵袭中[22-24]。聚-D-赖氨酸或是基质胶也可以选做细胞外基质来建立模型。其中基质胶可以形成厚而松散的交联凝胶，能够促进3D组织的生长。相比之下，胶原蛋白和层粘连蛋白则能够自发形成3D凝胶且具有固有的自发聚合能力。当然这种3D微环境也存在着许多缺陷。例如在培养ECs时，氧气、营养以及可溶性的生长因子的分布在整个培养层中是不均匀的，而且凝胶会随着介质的扩散出现梯度。而天然水凝胶的提取是从动物中分离出来，存在着组合后的变异性。合成水凝胶是由纯非天然分子所组成，这些分子具有生物惰性，并能够产生明确的3D微环境。其制作简单，方便适应机械力，且重现性高。希望在不久的将来能够出现具有天然水凝胶和合成水凝胶组合特性的ECM，以此来应对不同的3D微环境所导致不同的细胞反应。

2.4 微流体组织装置建立BBB模型：微流体组织装置是近年来受到较多关注的一个模型，有研究将其加入BBB模型的建造中，以此能够判断剪切应力对BBB的影响[25]。它将微工程技术与活细胞群体结合起来，较好的体现体内环境的组织特征，包括空间定义的共培养物和极化细胞的结构。在一个设计好的芯片方案中，通过使用“软光刻技术”将弹性体材料聚二甲基硅氧烷（PDMS）模塑成光定义的母模来制造微流体通道[26]。然后将多孔细胞培养基质（大多是聚酯或聚碳酸酯膜或薄的穿孔的PDMS膜）密封在通道网络之间[27-28]。这些通道使得膜的只有一侧能够通过，并将一些细胞群引入并附着在通道中。该装置能够维持细胞流动并不影响细胞增殖，施加剪切应力的同时诱导结合并建立极化组织。这种组织装置在过去的研究中已经成功地建立包括肺、肠以及脉管系统等屏障模型[29]。

邵晓剑等[30]构建了一个微流控芯片平台以模拟血脑屏障，他将平台分为三个模块：血脑屏障模型，包括中间夹有半透膜且上下交叉的直通道；三维细胞培养室，用于细胞毒性实验，微固相萃取柱芯片，用作样品进入质谱分析前的除盐和富集。实验测得的三维培养的脑组织细胞模型可进一步评测药物在脑部组织中的扩散和药效，药效结果也更接近体内数据。Brown等[31]将3D凝胶直接结合到微流体结构中来创建神经血管单元NVU。他将底部灌注通道从脑室与多孔膜分离，一端培养ECs，另一端培养周细胞以及星形胶质细胞。然后将脑室用人诱导的多能干细胞（hiPSC）衍生的神经元3D胶原Ⅰ凝胶填充。顶部灌注通道用来维持脑室的细胞活力。TEER测量的结果在细胞培养的12天内显著增加，内皮TJs的ZO-1染色，以及减少的FITC-缀合葡聚糖转运都可以证明屏障功能。

Herland等[32]采用“黏性指法”的方法在微流体的通道内建立了一个圆柱形的胶原凝胶[33]。为将聚合前胶原体的中心除去，在通道内充满胶原蛋白和可控的流动流体。然后将人的皮质星形胶质细胞包埋在大块的凝胶中，并依次将人的皮质周细胞和微血管内皮层细胞附衬在内腔表面，以此来创建神经血管单元NVU。这种方法成功实现了细胞生长所需的生理结构，并通过VE-钙黏蛋白和ZO-1染色验证了内皮单层及TJ的存在。这种方法还可以进一步用来探索NVU炎症的特性。

2.5 基于干细胞建立BBB模型的进展：以动物为来源所建造的BBB模型已经被广泛的应用到各项实验研究中，但由于物种的差异使得其不能够在临床神经科学和药物的开发上得以应用[34]。而分离原代人脑EC的有限性及高额的成本使得应用人的BBB体外模型的研究受到了阻碍[35]。而作为原代培养替代物的永生化人BBB内皮细胞系却具有单层完整性及较低的TJ蛋白表达。因此，在神经血管研究的领域开发出能够更加模拟出人体内环境的BBB模型仍是当前研究的重点。

近几年对于干细胞的研究有了新的科学进展，这使得研究该方面的各种人类疾病和有关药物的研究提供了新的研究途径[36-40]。多能干细胞和成体干细胞均表现出显着的自我更新能力，并且可以获得任何特定的细胞表型[41-42]。而诱导多能干细胞（iPSC）或胚胎干细胞（ESC）的开发也已经被用于建造体外人BBB模型[43-44]。同样人的脐带造血祖细胞也被人们用来建造体外人BBB模型。Ponio等[45]曾在星形胶质细胞存在的情况下，使用脐带血干细胞的内皮祖细胞集中定向诱导，产生了类似于hCMEC/D3细胞系的单层完整性的BBB模型性质。而与周细胞共培养的来源于造血干细胞的ECs所建立的BBB模型则显示出具有功能性和成熟性的反应，并具有持续性的屏障紧密性[46]。与其他的体外BBB模型相比，这种模型的稳定性远好于那些屏障紧密性差的模型。

对于原代神经元和星形胶质细胞分离的难题，使得胚胎及人脑神经元祖细胞（NPC）成为了建立体外稳定血脑屏障模型的潜在选择[47-48]。因为人脑神经元祖细胞（NPC）能够广泛增殖并可以分化出神经元和星形胶质细胞谱系，而这些谱系是BBB在体内发育和成熟的关键[48]。基于人类PSC的BBB模型建立的研究，Stebbins等[44]对使用各种hiPSC细胞系和优化人源化BBB模型方面的开发取得了很大的进展。该过程涉及hiPSC黏附培养未成熟的NPCs和EPC的分化，然后对EC基质的规格选择和纯化。纯化后的BMECs表现出细胞间轮廓的富集TJ蛋白的表达以及各种具有功能性的外排转运蛋白的极化表达。主要在于周细胞被视黄酸处理后调节IMR90-c4衍生的BMEC单层，可与分化的人的NPC共培养使得BBB表型富集。而除了视黄酸外，用于早期维持干细胞的基质源与分化前的初始hPSC接种密度，也显著影响BMEC的数量及BBB的紧密度。由此可见，hPSC衍生的BBB模型具有潜在的可能性作为可靠的药物筛选工具[49]。虽然可能需要更多的化合物来对此进行测试，但不可否认的是其利用前景。而且还可以将干细胞与微流体方法相结合，来开发用于高通量研究的更稳定强大的BBB模型平台。

2.6 以3D打印技术建立BBB模型：到目前为止，3D打印技术已经应用于复制人的皮肤、骨骼以及耳朵和肝脏等人体器官[50]，也被应用于创造灌注功能性的血管通道[51]。这种3D打印技术，包括平版印刷文件的打印是通过计算机断层扫描或是磁共振成像捕获的二维图像的层析重建所创造的。由于NVU具有很大的复杂性，使其在脑血管中的应用受到了很大限制，建立BBB模型的复杂环境还有待开发。

3 新药研发在BBB模型中的进展

新药研发与人类健康息息相关，能够促进人类卫生事业的发展和进步[52]。中枢靶向药物在治疗中枢神经系统疾病，如帕金森病，脑肿瘤以及阿尔茨海默病等疾病的难点就是在于血脑屏障的阻碍。而克服血脑屏障即成为了药物研发成功的关键所在[53]。

针对紧密连接，有研究人员通过高渗作用使脑内毛细血管内皮细胞暂时脱水而产生收缩，导致细胞体积变小间距变宽，进而通过被动扩散将药物带入脑内[54]。Cote等[55]则通过合成缓激肽及类似物能够破坏BBB通透性的特性，应用了两种新型强效BK激动剂，单用或合用来改变BBB的通透性，来提高药物生物利用度。Kim等[56]发现通过腺苷受体信号调节机制能够影响细胞骨架分子，从而引起内皮细胞形状发生改变，使得紧密连接开放，BBB的通透性提高。针对转运蛋白的功能，P-gp作为能够识别和外排异源物的底物，成为了药物进入脑内一道难以逾越的障碍。使用相应的抑制剂，虽减少其抑制的功能，但临床效果并不佳[57]。而通过溶质载体，可帮助分子穿过细胞屏障，其中Ronaldson等[58]发现通过TGF-β/ALK5信号通路上调作用，能够使Oatpla4相应的底物增加摄取量，以此来作为潜在的靶点，对BBB内流转运蛋白的功能性表达进行精确的控制，引导药物转运至脑内。针对定点释放药物，如今聚集超声应用热和力学机制，非集中性的集中到身体内部，能够产生广泛的生物效应，目前有些外科手术尝试应用于脑部的非入侵性消融治疗[59]。Hirschberg等[60]使用外源性或内源性光敏剂，采用成功可逆开放选定区域的BBB，实现了递送药物和MRI对比剂的目的。对于血脑屏障以及作用药物的研究还在不断的进行中，更深入了解转运系统和细胞内的信号转导通路，发现和发掘新型的神经系统药物，还需我们更加深入的探索。

4 现状与展望

血脑屏障在脑内缺乏开窗，以限制外源性物质的进入，从而起到对脑部神经中枢保护的作用。NVU细胞之间的相互作用及影响是对BBB功能的形成及维持至关重要的。随着生物技术的不断进步以及人们研究的不断深入，在体外建立BBB模型方面的研究也从细胞间通过Transwell共培养所建立简单的体外BBB模型，到通过永生化细胞系、微流体装置以及3D细胞外基质等方法来使得BBB模型更加复杂并具有功能性，更加贴近体内环境的同时且能够维持更久的屏障功能。使得人们在科研道路上取得新的进展的同时，也为研究脑内相关疾病及药物研发的工作者提供了新的线索。