发酵法生产纳豆激酶的研究进展

文 雯 ，周 博，胡莉娟

（1.杨凌职业技术学院药物与化工分院，陕西杨凌 712100；2.中国药科大学，江苏南京 211198）

纳豆激酶（Nattokinase，NK） 最初是由日本心脑血管专家须见洋行教授从纳豆发酵过程中提取得到的一种碱性丝氨酸蛋白酶[1]。研究表明，纳豆激酶溶血栓能力强，可通过直接和间接双重作用来持续发挥其纤溶活性[2-3]。通过体外溶栓试验发现纳豆激酶可以很好地溶解纤维蛋白凝块[4]，体内大鼠静脉注射纳豆激酶试验表明纳豆激酶纤溶活性是血纤维蛋白溶酶的4倍以上[5]。也有研究表明，健康人口服纳豆激酶可以缩短优球蛋白溶解时间[6]。目前，纳豆激酶主要通过微生物发酵法生产，主要对发酵法生产纳豆激酶过程中菌种选育和发酵工艺2个方面进行总结，以期为纳豆激酶生产提供参考。

1 菌种选育

作为微生物工业化发酵三大技术领域之一的菌种选育，在微生物药物的发酵生产中有着至关重要的地位。当前，发酵工业中使用的生产菌株，大部分都是通过不同的育种技术而得到的具有高产目的产物的菌株。

1.1 传统诱变剂诱变

使用传统的物理诱变剂和化学诱变剂处理均匀分散的菌悬液，通过物理辐射和化学试剂能与D NA相互作用的特点实现对菌种遗传物质的改变，进而筛选出少数优良性状的突变株。

1.1.1 紫外诱变

紫外线是使用最广泛的物理诱变剂，当它照射微生物细胞时，会导致微生物D NA分子形成嘧啶二聚体，进而可能引起菌株突变或死亡。薛健等人[7]利用20 W紫外灯照射纳豆激酶生产菌90 s，获得了1株产纳豆激酶酶活达498.84 IU/mL菌株，比原始菌株提高了6.78%。王雅君等人[8]使菌悬液在距离紫外灯28～30 cm的位置，最佳照射时间为60 s时，经过初筛和复筛得到正突变纳豆芽孢杆菌U49，其产纳豆激酶酶活为1 329.62 IU/mL，比出发菌株Z1提高了100.34%。余功保等人[9]采用紫外诱变成功筛选出了BSN-3菌株，该菌株的酶活比原始菌株酶活提高了258%。

1.1.2 亚硝基胍诱变

具有超诱变剂之称的亚硝基胍（NTG）是一种烷化剂，在处理放线菌、细菌等微生物时，能使它们的细胞发生连续突变，不经淘汰就可以直接得到10%以上的营养缺陷型突变株。沙维[10]采用0.3 mg/mL亚硝基胍对T-3纳豆杆菌处理20 min，诱变2轮，筛选得到突变株Y2-1菌株，其产纳豆激酶活力比原始菌株提高14.8%，达到5 740 IU/mL。

1.1.3 硫酸二乙酯诱变

硫酸二乙酯（D ES）也属于烷化剂的一种，是一种常见的化学诱变剂。许建平等人[11]对枯草杆菌B826进行硫酸二乙酯处理，并筛选得到高效稳定的突变株。

1.2 新型诱变剂诱变

近年来，在诱变育种方面除了经常使用的传统的诱变剂以外，还开发出一些新型的诱变剂，比如微波、超声波、激光、离子注入和高能电子流等，它们在诱变育种中取得了较好的效果。下面介绍几种纳豆激酶生产菌株使用过的新型诱变剂。

1.2.1 微波诱变

微波是近年来发展较快的新型物理诱变剂，研究表明一定频率的微波会干扰细胞内D NA分子氢键和碱基堆积力，进而对微生物产生一定的致死能力和诱变效应[12]。沙维[10]用380 W微波在加热累计时间40 s的条件下，经过2轮诱变筛选得到突变株W2-1，其发酵得到的纳豆激酶酶活为5 450 IU/mL，比原始株提高9%。王雅君等人[8]对纳豆芽孢杆菌Z1采用微波诱变，经过筛选得到突变株W51，其相对纳豆激酶活力为735.19 IU/mL。

1.2.2 离子注入诱变

离子注入是20世纪80年代初兴起的一种处理材料表面的高新技术，所谓离子注入诱变，就是利用低能离子注入生物体引起遗传物质改变，造成性状变异，达到育种目的方法[13-14]。这种诱变方法具有方向性和可控性，高宏[15]将30×2.6×1 013～200×2.6×1 013 ion/cm2N+注入枯草芽孢杆菌，最终得到稳定遗传突变株，酶活比原始菌株提高了160%。

1.2.3 超声波诱变

超声波会导致微生物菌体细胞内的空化作用，其产生的高温和高压在一定条件下可以使细胞具有突变的可能性。目前，利用超声波诱变育种已有很多报道，超声的功率、频率和时间是超声波诱变的关键因素。沙维[10]用70 kHz，220 W超声波对原始菌株累积处理25 min，筛选获得突变株C2-1菌株，其发酵生产的纳豆激酶活力达到5 585.35 IU/mL，比原始菌株提高了11.7%。

1.2.460C o-γ射线诱变

60Co-γ射线是高能电磁波的一种，其可以产生较强的电离辐射，该辐射可作用于微生物细胞的遗传物质，发生染色体断裂，从而引发基因结构变化，致使微生物的突变。李淑英等人[16]用800 Gy的60Co-γ射线诱导纳豆激酶生产菌，一共得到60株活性增加的菌株。古亚楠[17]用500 Gy60Co-γ射线诱变纳豆菌菌株，正向突变率3.4%，并筛选得到1株酶活为2 040.54 IU/g的菌株。

1.3 复合诱变

复合诱变也称联合诱变，一般指先后使用2种或2种以上的诱变剂或者多种诱变剂同时使用。如果诱变剂合理搭配使用，则一般效果优于单一的诱变，会产生协同效应。关志炜[18]通过物理诱变剂紫外线和化学诱变剂盐酸羟胺进行复合诱变处理，采用利福平抗性平板和发酵相结合的筛选方法，获得了突变株NU9012，其产酶能力提高了68%，达到648 IU/mL。蔡超靖等人[19]采用光敏试剂8-甲氧基补骨脂素和紫外诱变相结合，对根酶Rh23原生质体进行复合诱变，得到了高产且发酵性能稳定的突变株。桂丽等人[20]采用微波和紫外线复合诱变，最终筛选得到产纳豆激酶活力为2 200 IU/g的突变株。

1.4 原生质体技术育种

原生质体对诱变剂的敏感性高于孢子或菌体细胞，将原生质体再生与原生质体诱变相结合，已经成为微生物育种的重要手段。刘新梅等人[21]对纳豆菌B.N.K菌株的原生质体再生育种，试验结果表明，直接再生发生了正突变，提高了纳豆激酶酶活力，并且发现原生质体直接再生菌株虽可产生变异，但变异幅度较原生质体经紫外诱变要小。试验采用原生质体技术和紫外诱变联合技术最终获得产纳豆激酶酶活较高的菌株U V103，U V212。

1.5 基因工程技术育种

虽然工业生产中使用的高产菌株大多是通过物理或化学手段进行诱变育种得到的，但是随着时代的进步，传统诱变方法的诱变盲目性、筛选工作量大、遗传不稳定等缺点越来越凸显。越来越多的人利用基因工程育种技术对原始菌株进行有目的、定向的改造，并取得了显著的成效。W ei X等人[22]利用P CR基因扩增技术筛选出1株纳豆激酶高产菌株。赵菡等人[23]通过对远离酶活性中心的Asn和Gln位点进行突变体构建，最后筛选得到突变体Q59E，催化活性显著提高。Y ongjun C等人[24]利用D NA shuffling技术筛选得到纳豆菌产纳豆激酶活力提高了2.3倍。Y ou L等人[25]采用连续循环易错P CR技术在枯草杆菌蛋白酶E中引入随机突变并筛选突变文库，获得活力提高的突变体。

2 发酵工艺的优化

为了提高纳豆激酶的活力，除了菌种选育以外，还需要对发酵过程中各种参数条件进行试验设计考查。

2.1 液体发酵

液体发酵主要指借助于液体介质来完成的发酵。此种发酵方式成本低廉、菌体生长快速、发酵周期短、可以进行大规模生产。目前，我国许多科研院所都对纳豆激酶的液体发酵工艺条件进行了研究。梁剑光[26]通过研究发现当碳源为可溶性淀粉、氮源为大豆蛋白胨时，最终酶活提高2倍。古亚楠[17]通过对培养基内的碳、氮源优化，产纳豆激酶活力较之前提高了19.5 IU/mL。Kwon E Y等人[27]采用高密度分批补料使纳豆激酶活力高达14 500 U/mL。田艳[28]发现发酵12 h时添加0.1%的油酸钠有助于酶的分泌。

目前液体发酵生产纳豆激酶的工艺中，常见使用的氮源是大豆蛋白胨、蛋白胨和豆粕粉等，常用碳源有可溶性淀粉、木糖和玉米淀粉等。除此以外，培养基组成一般还含有磷酸盐。根据纳豆激酶属于初级代谢产物的特点，产酶阶段集中在微生物生长对数期后期和稳定期前期，故发酵周期不应过长。纳豆激酶多为耗氧菌产生，故发酵过程中需氧量较大，发酵转速不能过低。

2.2 固体发酵

固体发酵是指微生物在没有或基本没有游离水的固态机制上的发酵方式。目前也有大量研究者采用该方式进行纳豆激酶的发酵，常用的基质为蒸煮过的黄豆，通过考查不同培养条件对纳豆激酶的影响。黄婷[29]以黄豆为基质，采用初始含水量51%，接种量0.15%，在43℃下固体发酵24 h，得到的纳豆激酶含量达0.076 mg/mL。路龙女等人[30]以破碎大豆为基质，接种量8%，发酵24 h，纳豆激酶活力最高达976 IU/g。张杰等人[31]采用破碎度为四瓣，在90℃下烘炒5 min的黄豆进行固体发酵，添加3%的魔芋精粉，接种量8%，在37℃下发酵1 d，得到的纳豆激酶酶活为3 582.48±83.13 U/g。李永飞等人[32]研究了蔗糖、葡萄糖和谷氨酸钠3种物质对固体发酵纳豆激酶的影响，发现添加蔗糖和谷氨酸钠有助于提高产酶，而添加葡萄糖反而抑制。

目前，纳豆激酶固体发酵的原材料不断改进，以黄豆为基础，开发了鹰嘴豆、芸豆、麸皮等新的固体发酵基质，并且不断优化发酵条件，力求在纳豆激酶的生产过程中不断创新。

3 结语

伴随着人口老龄化问题日益严重，心脑血管疾病尤其是血栓病已经成为威胁人类的头号杀手，而溶栓是治疗该类疾病的重要手段。目前，临床上的溶栓药物主要有尿激酶、链激酶和纤溶酶原激活因子，但在一定程度上均存在副作用大、成本高、在体内半衰期短等缺陷，纳豆激酶在这些方面正好弥补了这些不足。除了溶栓作用，纳豆激酶还有辅助降血压、降血脂等功效。但是，纳豆激酶产率不高一直是限制其进一步开发的重要原因。目前，纳豆激酶大多通过发酵法制得，无论其产生菌的菌种选育还是发酵工艺优化都对纳豆激酶的产量起着重大影响。利用基因工程技术、多种育种方法相结合，优化发酵工艺，进一步探究纳豆激酶发酵过程机理，提高纳豆激酶产率，开发出更多满足人们需求的新产品，具有广阔的前景。