非酒精性脂肪性肝病患者肠道菌群及其代谢产物的作用

孙婷婷

随州市中心医院消化内镜室 (湖北 随州市， 441300)

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是指除酒精和其他明确因素如病毒性肝炎、药物性脂肪肝等所致,与胰岛素抵抗以及代谢综合征密切相关的疾病, 包括单纯性脂肪肝(NAFL)及由其演变的非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、肝纤维化、肝硬化以及肝癌。NAFLD发病呈全球化流行趋势，近年来其发病率逐年提高并呈低龄化起病。2016年一项对22个国家的86项研究的荟萃分析结果显示，NAFLD的总体患病率为25.24 %(22.10 %～28.65 %)，中东和南美的患病率最高，非洲的患病率最低。2014年我国流行病研究的荟萃分析结果发现，NAFLD的患病率为20.09 %[1]。但NAFLD的发病机制尚未完全清楚，肝脏作为门静脉血流的首过器官，与肠道菌群和肠源性物质不仅在解剖上而且在功能上有着密切的联系，肠道微生态系统含有人体最大的贮菌库及内毒素池，菌种达500～1 000余种，总重量约1 000 g，基因组更是人体基因组的150多倍[2]，随着检测手段的发展，越来越多的研究结果显示，肠道菌群失衡参与NAFLD的发生和发展，而恢复肠道微生态平衡则有望成为防治NASH的新策略。

1 脂肪性变和脂肪性肝炎

目前对脂肪性变或脂肪性肝炎患者肠道菌群组成的检测研究有限，实验结果也不尽相同。Mouzaki等[2]通过对膳食脂肪摄入和IBM进行线性回归调整后，对粪便菌群进行qPCR检测，结果提示与单纯性脂肪肝患者及健康对照组相比，NASH患者粪便中的拟杆菌门百分比是下降的，而其他菌属(包括梭状芽孢菌、双歧杆菌属、埃希氏杆菌属和古生菌)在两组之间无明显差异性。然而，Zhu等[3]的一篇文章显示拟杆菌的丰度又是有所增加的，在其实验中分别对NASH、肥胖、健康对照组的肠道菌群进行16SrRNA焦磷酸测序，结果显示拟杆菌门与正常对照组相比，在肥胖和NASH组中成6倍值的增加。而双歧杆菌属的丰度在健康对照组、肥胖组、NASH组是逐渐减少的；厚壁菌门的丰度与健康对照组相比，在肥胖和NASH组中是降低的；梭菌属在所有组中具有相近的表达；变形杆菌门、肠杆菌科、埃希氏杆菌属的过表达在肥胖和NASH患者微生物群里存在一致性显著性差异。另一个实验却揭示了在NAFLD患者中厚壁菌属含量的增加，Raman等[4]在这个试验中通过多标记焦磷酸测序对肥胖NAFLD患者和健康对照组的粪便微生物进行检测，结果提示在NAFLD患者中乳酸杆菌属和厚壁菌属的过表达差异有统计学意义。

Malaguarnera M等[5]将66例NASH患者随机分为共生元组(即长双歧杆菌和益生元)和对照组，经过24周的治疗发现共生元组的炎症标志物(即肿瘤坏死因子-α，C反应蛋白)以及脂肪变性和NASH活性指数显著下降。研究表明体重增加、脂肪堆积、脂肪性肝炎之间存在因果关系，无菌饲养的小鼠体内脂肪总量低于携带正常肠道微生物的小鼠，将正常小鼠的肠道菌群移植至无菌小鼠肠道内，其甘油三酯可增加两倍，肝脏的脂肪从头生成表达更高[6]。肠道菌群的改变减少了肝脏脂肪生成和血浆甘油三酯，从而显示出人类中微生物群和肝脏之间的第一个代谢联系之一。肠道菌群的发酵作用增加了盲肠和门静脉血液中短链脂肪酸的丰度，其中乙酸盐和丙酸盐的浓度都加倍，丙酸盐可以穿过肠屏障并通过门静脉血液到达肝脏，通过作用于脂肪生成中涉及的几种限速酶的转录而抑制脂肪生成，而乙酸盐可作为胆固醇或脂肪酸合成的前体[7]。肠道中的细菌可发酵碳水化合物而产生短链脂肪酸(SCFAs),其中以乙酸盐、丙酸盐和丁酸盐总含量为最高，三者约占短链脂肪酸的90%～95%，短链脂肪酸不仅具有氧化供能的作用，而且还有维持水电解质平衡、抗病原微生物及抗炎、调节肠道菌群平衡、改善肠道功能、调节免疫、抗肿瘤和调控基因表达等重要作用。

Zhu和Raman 等[3，4]分别对外周血乙醇进行监测以及粪便挥发性有机化合物(VOC)进行气相色谱分析-质谱分析，结果显示与对照组相比，实验组外周血以及粪便中的乙醇含量显著性升高。Zhu[3]等研究了NASH儿童和肥胖儿童相比，血液中乙醇浓度显著性升高，而肠道中变形菌门、肠杆菌科、埃希氏菌属的丰度亦显著增加，结合对微生物丰度的表达，考虑系产乙醇细菌的过度生长可能导致了实验组血乙醇含量的增加。而内源性乙醇的产生促进了自由脂肪酸和氧化应激，加强了产乙醇细菌在NAFLD病理过程中的角色[8]。乙醇的高毒性代谢产物——乙醛及其代谢衍生物，可损害各种细胞器和酶的结构功能；刺激免疫系统，诱发免疫反应性肝损害；损害线粒体脂肪酸的β氧化，引起脂质过氧化反应，抑制谷胱甘肽的生物合成，减弱超过氧化物酶等抗氧化功能[9]。也可通过引起紧密连接的重新分布以及改变细胞内信号传导途径，导致肠黏膜上皮细胞紧密连接破坏和大分子的细胞旁通透性升高，从而破坏肠黏膜屏障。由于肠黏膜屏障的破坏，所以内生性乙醇的增多往往伴随着肠源性内毒素通过门静脉进入肝脏的增加，导致肝脏的损害[10]。

2 肝纤维化和肝硬化

Minicis等[11]通过结扎介导肝纤维化小鼠模型，对无菌小鼠经口灌肠分别移植高脂饮食和正常对照小鼠肠道菌群后观察得出，高脂饮食组小鼠肝纤维化程度比对照组增加，其肠系膜淋巴结活检显示一个高密度的感染，提示高脂饮食组小鼠肠道细菌移位。通过焦磷酸测序检测，显示高脂饮食组小鼠肠道G-变形杆菌比例较对照组增加，双歧杆菌比例较对照组减少。与健康者相比，肝硬化患者肠道致病菌比例更高，原著细菌比例更低。Liu等[12]通过基于16SrRNA的PCR-变性梯度凝胶电泳检测了正常人和肝硬化患者肠道所有菌群，并证实其差异有统计学意义。且通过实时PCR检测证实了与健康对照组相比，肝硬化组肠杆菌科和肠球菌科的增加有显著性差异。Bajaj等[13]通过对肝硬化代偿期和失代偿期患者肠道菌群进行对比发现，失代偿期患者毛螺菌科、瘤胃菌科、梭状芽胞杆菌等原著细菌分类显著减少，而葡萄球菌科、肠杆菌科等致病菌显著增多。与健康对照组相比，肝硬化恶化患者的紫单胞菌科含量是显著性下降。Kakiyama等[14]通过与对照组相比，肝硬化患者肠道致病菌肠杆菌科的丰度是更高的，毛螺菌科、瘤胃菌科的丰度是降低的。

大量实验证实肝纤维化时G-菌等致病菌含量增多，其中变形杆菌和厚壁菌属是两种专性产酶菌，可催化胆碱转化为甲胺，三甲胺经肠粘膜吸收入肝脏，在肝脏内氧化代谢为氧化三甲胺。血浆氧化三甲胺通过促进前胆固醇转运和抑制胆固醇逆向转运加速动脉硬化。而且，氧化三甲胺加速糖耐量损伤，阻碍肝脏胰岛素信号，促进脂肪组织炎症，已有大量研究证实血浆氧化三甲胺与肾功能损伤、结直肠癌、冠心病有明确的相关性[15]。氧化三甲胺含量增多和胆碱含量的减少均可引起机体损伤。胆碱是细胞膜和线粒体膜的重要组成部分，乙酰胆碱在脂质代谢、第二信使信号转导、胆固醇和胆汁酸的肝肠循环代谢等生理过程中起着重要作用，因此，胆碱缺乏可引起脂肪肝的形成[16]。Melanie等[17]研究了低胆碱饮食介导脂肪肝及肠道微生态的改变之间的联系。在这个研究中，15名健康女性接受为期2个月的不同胆碱水平的饮食干预，其中包括10 d的正常饮食(包含550 mg胆碱，50 mg甜菜碱/70 kg体重)，42 d的低胆碱饮食(<50 mg胆碱，6 mg甜菜碱/70 kg体重)。结果显示低胆碱饮食干预后肠道菌群的组成与脂肪肝的形成具有相关性。以甲硫氨酸-胆碱缺乏的饮食喂养小鼠4周后可以复制NAFLD或NASH的模型，表现为肝酶升高、肝脏甘油三酯沉积和脂质过氧化发生。在动物实验中，高脂喂养小鼠可以刺激肠道菌群胆碱转化为酶的活性增强，从而导致宿主胆碱生物利用度的下降，发生NAFLD[18]。

肝纤维化时原著菌群减少导致胆汁酸的代谢紊乱。胆汁酸的早期解离、7α-脱羟基以及脱氢依赖于细菌。无菌小鼠胆汁酸的合成增多，同时粪便胆汁酸减少，胆汁酸池的蓄积增多，这进一步论证了胆汁酸的合成、代谢以及在回肠末端的吸收与肠道细菌有关。回肠细菌分泌的成纤维细胞生长因子19(Fgf19)通过门静脉循环至肝脏减少胆固醇7-α羟化酶(Cyp7A1)的转录，胆固醇7-α羟化酶(Cyp7A1)是胆汁酸合成的限速酶[19]。胆汁酸除了促进脂肪、胆固醇、脂溶性维生素在小肠内的吸收，也作为一种信号分子调节一系列的生理过程。这些过程包括胆汁酸自身代谢的平衡、脂蛋白和葡萄糖的代谢等，因此，胆汁酸和它们的代谢物在肝脏内甘油三酯、胆固醇和葡萄糖的平衡中起着重要的作用。胆汁酸平衡及其调节信号途径的失调促进了NALFD的发展[20]。胆汁酸有强效的抗菌活性，然而肠道菌群的组成对胆汁酸的代谢也产生了强大的影响。例如小鼠体内胆酸(CA)含量的增加可以促进梭状芽胞杆菌丰度的增加[2]。高脂饮食介导的代谢改变了包括胆汁酸改变，而这些改变是与肠道菌群的重塑有关，同时胆汁酸的失调也改变了肠道菌群的组成，肠道菌群的改变通过影响脂质和能量代谢又促进了NAFLD的形成[21]。此外肠道微生物组介导的胆汁酸代谢可通过NKT细胞调节肝癌。改变小鼠体内共生肠道细菌可诱导肝脏NKT细胞增加及干扰素α 增加，体内研究表明NKT细胞介导肝脏的选择性肿瘤抑制作用。NKT细胞的聚集由肝窦内皮细胞通过CXCL16的表达调控，而CXCL16的表达是由肠道微生物介导的初级到次级胆汁酸的转化控制[22]。

3 肠道菌群定向治疗NAFLD

越来越多NAFLD形成中肠道菌群功能的证据对肠道菌群定向预防或治疗NAFLD策略提供了重要的基本原理。最常用的肠道菌群干预方法包括补充益生菌、益生元和合生元，或者是抗生素的治疗。

在临床，益生菌VSL#3或者是与其他益生菌的合用体被用于NAFLD患者的治疗，结果显示血浆中转氨酶、TNF-a和氧化应激在治疗3个月后较前好转。此外，除了直接调控，益生菌也可以抑制有害细菌在小肠黏膜的粘附，减少炎症反应，加强宿主免疫功能，而这些在肝脏慢性损伤的治疗中也有疗效[23]。

益生元是一类不可降解食物作料，包括果聚糖、低聚糖、乳果糖、抗解淀粉等其他。这些食物作料不能直接被人体吸收和利用。他们必须在肠道细菌作用下转化成可吸收代谢分子比如短链脂肪酸SCFAs(乙酸、丙酸、丁酸)，益生元能刺激有益菌的生长例如乳酸杆菌和双歧杆菌，达到保护宿主代谢的作用[24]。此外益生元可以调控宿主的食欲和能量代谢，通过改变各种肠道多肽的释放。在肥胖动物，饮食果聚糖增加10 %可使肠道厌食神经多肽(PYY，GLP-1)的释放增加，同时使刺激食欲的饥饿素减少。在GLP-1受体缺陷的动物模型中益生元调节的饱腹感被进一步证实。益生元能提高肠道内源性大麻素，降低肠壁通透性，减弱内毒素代谢和最终减少脂肪积累，阻止肥胖和NAFLD的形成[25]。

共生元是益生菌和益生元的结合。在NASH患者中，研究者通过持续的双歧杆菌和低聚果糖治疗6个月，观察患者血清ALT、AST变化，结果表明共生元治疗的患者AST水平与对照组相比是显著性降低的，这表明共生元在治疗NASH患者中的潜在优势[26]。

尽管有关益生菌、益生元、共生元的相关有益证据已经获取，但其中一些结果在不同实验、临床实验中有差异。考虑到肠道内大量细菌数量和组成，这里有许多明确的因素可以导致同一益生菌治疗结果的不一致，比如益生菌制备工艺、宿主基因、饮食、生活习惯等。同时，也包括微生物靶向治疗结果的检测准确度，这些需要进一步试验和大规模的临床调查。

4 总结

随着DNA测序技术的快速发展，越来越多与NAFLD相关的特异性菌种将被逐步发现，从而进一步带动发病机制的研究。然而，现有研究在所得结果之间有着巨大差异，可能是由于样本量小，患者队列的变异性，不同的采样技术以及分析方法等原因。为进一步说明肠道菌群与NAFLD之间的关系，需要进行大规模前瞻性研究以及连续性采样，此外也要充分考虑饮食、药物使用、抽样法等其他可能导致差异的原因。肠道菌群在NAFLD发病中起着重要的作用，其相互影响机制有待于进一步研究。