熊去氧胆酸对小鼠酒精性肝损伤的保护作用

尤梅桂，吴雅茗，许雅苹



熊去氧胆酸对小鼠酒精性肝损伤的保护作用

*尤梅桂1.2，吴雅茗1.2，许雅苹1.2

（1．厦门医学院基础医学部，福建，厦门 361023；2．机能与临床转化福建省高等学校重点实验室，福建，厦门 361023）

研究熊去氧胆酸（UDCA）对小鼠酒精性肝损伤的保护作用。将昆明种小鼠60只随机分为正常对照组、模型组、联苯双酯组（200 mg/kg）、熊去氧胆酸低剂量组（UDCA-L（30 mg/kg）），熊去氧胆酸中剂量组（UDCA-M（60 mg/kg））、熊去氧胆酸高剂量组（UDCA-H（120 mg/kg））。除正常对照组外，其余各组均灌胃给药，1次/d，连续10 d，灌胃容积为0.2 mL/10g。每日灌胃给药30 min后，除正常对照组灌胃等容积的蒸馏水外，其余各组小鼠均灌胃35度二锅头白酒16 mL/kg，造酒精性肝损伤模型。10 d后，观察小鼠肝脏、脾脏系数、检测血清ALT、AST，肝组织 SOD、GSH、MDA、NO的水平。HE染色，观察肝病理变化。UDCA各剂量组均可降低小鼠脾脏系数和血清ALT、AST 活性，升高肝组织SOD、GSH 活性，并降低肝组织MDA和NO含量（< 0.05或＜0.01）。UDCA对小鼠酒精性肝损伤有一定的保护作用。

熊去氧胆酸；酒精性肝损伤；小鼠

长期大量饮酒所致的肝脏疾病也称为酒精性肝病（alcoholic liver disease，ALD）[1]，大体病理过程表现为酒精性脂肪肝、肝炎、肝纤维化、肝硬化[2]。肝脏损伤程度与饮酒时间长短、饮酒量多少及患者营养状态密切相关，需引起我们注意的是酒精性肝病常常伴随着很多的并发症。虽然国内外研究学者已经对酒精性肝病的发病机制、药物治疗、药物作用机制进行了大量的研究，也试图开发更多新型的、有效的保肝药，但临床上对其尚缺乏较为有效的治疗方法和特效药。因此，寻找安全有效的治疗药物迫在眉睫。本研究就熊去氧胆酸对小鼠酒精性肝损伤的保护作用进行研究，旨在为临床应用更为安全有效的治疗药物提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

昆明种小鼠60只，20~24月龄，体重17~22g，由福建医科大学动物实验中心提供。动物合格证号为（SCXK（闽）2012-0001），在室温环境下分笼饲养，实验前预养3d。

1.2 实验药品和试剂

熊去氧胆酸片（优思弗），规格：每片中含熊去氧胆酸50 mg，购自上海中西三维药业有限公司。联苯双酯滴丸，规格：1.5 mg/丸。临用前分别用0.5%羧甲基纤维素钠（CMC-Na）配置成所需浓度；ALT、AST、SOD、GSH、MDA、NO检测试剂盒均购于南京建成生物工程研究所。

1.3 实验仪器

Multiskan全波长酶标仪（美国热电），5804R台式高速常压离心机（德国eppendoff公司），Exceed-bd-24系列实验室超纯水机（成都唐氏唐宁科技发展有限公司），Satorius分析天平（北京多利丝天平有限公司），WH-861旋涡混合器（上海环球物化仪器厂）。

1.4 实验动物分组与处理

60只昆明种小鼠，雌雄各半，随机分成6组，每组10只，即正常对照组、模型组、联苯双酯组(200 mg/kg)、UDCA-L(30 mg/kg)、UDCA-M (60 mg/kg)、UDCA-H(120 mg/kg)。除正常对照组和模型组给予0.5%羧甲基纤维素钠外，其余4组均灌胃给药，每天1次，连续10 d，灌胃容积为0.2 mL/10g。

1.5 动物模型的建立

每日灌胃给药30 min后，除正常对照组外，其余各组小鼠均灌胃35度二锅头白酒16 mL/kg，正常对照组灌胃等容积的蒸馏水。第10 d给酒后禁食不禁水，24 h后称重，采集血和肝脏、脾脏标本，作相关指标检测。

1.6 检查项目及方法

①小鼠肝脏、脾脏系数的检测：小鼠颈椎脱臼处死后，取肝、脾脏，用4℃生理盐水冲洗，滤纸吸干，称重，计算肝脏、脾脏系数。脏器系数（%）= 脏器重量（g）/体重（g）×100%；②生化指标的检测：小鼠摘眼球取血，3500 r/min离心10 min，分离血清，检测血清ALT、AST含量。取肝右叶相同部位的一小块肝组织，以4℃生理盐水制成10% 肝匀浆，2000 r/min离心10 min，取上清液按试剂盒说明书测定肝组织SOD、GSH的活性及MDA、NO的含量。肝脏病理组织学检查：大鼠肝脏用10%甲醛固定，取材、脱水、浸蜡、包埋，再切成4 μm厚切片，HE染色，光镜下观察并拍照（×200）。

1.7 统计学分析

2 结果

2.1 UDCA对小鼠酒精性肝损伤肝、脾脏系数的影响

与正常对照组比较，模型组小鼠肝脏、脾脏系数均明显升高，差异具有显著性（< 0.05）。与模型组比较，各给药组均可以降低脾脏系数（< 0.05）；与模型组相比，除UDCA-H组可以降低肝脏系数（< 0.05）外，其他各组均降低了小鼠肝脏系数，但差异无统计学意义（< 0.05）。结果见表1。

表1 UDCA对小鼠肝脏、脾脏系数的影响（ ± s，n = 10）

注：与正常对照组相比，#< 0.05，与模型组比，*< 0.05

2.2 UDCA对小鼠血清生化指标的影响

与正常对照组比较，模型组小鼠血清ALT、AST含量显著升高（< 0.01）。与模型组相比，除UDCA低剂量组外，各给药组均能降低小鼠血清ALT、AST的含量（< 0.01），表明UDCA对小鼠酒精性脂肪肝的具有保护作用。结果见表2。

表2 UDCA对小鼠血清ALT、AST的影响（ ± s，n = 10）

注：与正常对照组相比，#< 0.05，##< 0.01，与模型组比*< 0.05，**< 0.01

2.3 UDCA对肝组织SOD、GSH活性和MDA、NO含量的影响

与正常对照组相比，模型组小鼠肝组织SOD、GSH活性和MDA、NO含量差异均有统计学意义（< 0.01）。与模型组比较，UDCA各给药组均升高了小鼠肝组织SOD、GSH活性，并显著降低肝组织MDA和NO的含量（< 0.05或< 0.01）。表明UDCA可能通过抗氧化应激的作用机制发挥保肝作用。结果见表3。

表3 UDCA对小鼠肝组织SOD、GSH活性和MDA、NO含量的影响（±s，n = 10）

注：与正常对照组相比，#< 0.05，##< 0.01，与模型组比*< 0.05，**< 0.01

2.4 UDCA对肝组织形态学变化的影响

正常对照组小鼠肝小叶、汇管区结构正常，肝组织未见明显变性、坏死，无炎症细胞浸润等病理改变；模型组肝小叶区细胞索状排列絮乱，出现肝脂肪变性，胞浆疏松，并且有少量炎症细胞浸润等病理改变；阳性组、UDCA高、中剂量组：肝小叶汇管区、中央静脉区细胞索状排列清晰，仅小部分肝细胞脂肪变性。UDCA低剂量组：肝细胞出现轻、中度脂肪样变性及胞浆疏松，部分肝细胞溶解坏死呈空网状病灶。结果见图1。

A.模型组 B.正常对照组 C.联苯双酯组 D. UDCA-H组 E. UDCA-M组 F. UDCA-L组

3 讨论

熊去氧胆酸具有改变胆汁酸池组成、抗氧化、调节免疫、保护肝细胞膜、增加胆汁中碳酸氢盐等作用，还可抑制肝细胞凋亡而显著改善肝功能和肝组织学病变，进而改善患者酒精性肝炎[3]。因此，熊去氧胆酸在临床上也可作为重要肝病治疗辅助用药。

由酒精性肝损伤引起的酒精性肝病是仅次于病毒性肝炎的第二大肝病[4]。研究表明，人体摄入大量酒精之后，乙醇会脱氢氧化变成乙醛，乙酸进一步氧化变成乙酸，如果人体缺少乙醛脱氢酶，不能将乙醛代谢，会使三羧酸循环出现障碍，进而影响脂肪代谢，使脂肪在肝细胞内堆积下来[5-6]，最终导致肝细胞肿胀坏死，而目前尚缺乏特效药物治疗。血清中AST、ALT含量作为早期肝损伤的重要指标，可直接反映肝细胞损伤程度[7-9]。

本实验研究结果显示，与正常对照组比较，模型组小鼠血清AST、ALT含量显著性升高，而熊去氧胆酸能显著降低ALT、AST水平，表明熊去氧胆酸对酒精引起的小鼠肝损伤起到一定的保护作用。实验研究还显示，UDCA能升高肝组织SOD、GSH 活性，并降低肝组织MDA和NO含量，因此我们推测UDCA的保肝作用机制可能是通过抗氧化应激对抗酒精引起的脂质过氧化作用，发挥保护肝细胞的作用。随着UDCA剂量的加大疗效不断增强，提示熊去氧胆酸对酒精性脂肪肝的保护作用呈剂量依赖性。随着临床医学研究技术的深入，有关UDCA保肝作用的分子机制有待进一步的研究探索。

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PROTECTIVE EFFECTS OF URSODEOXYCHOLIC ACID AGAINST ALCOHOL-INDUCED HEPATIC INJURY IN MICE

*YOU Mei-gui1.2, WU Ya-ming1.2, XU Ya-ping1.2

(1. Department of Basic Medicine, Xiamen Medical College, Xiamen, Fujian 361023, China; 2. Key Laboratory of Functional and Clinical Translational Medicine, Fujian Province University, Xiamen, Fujian 361023, China)

To study the protective effect of ursodeoxycholic acid (UDCA) on alcoholic liver injury in mice.Kunming mice were randomly divided into normal group, model group, bifendate group (200 mg/kg), UDCA-L (30 mg/kg), UDCA-M (60 mg/kg), UDCA-H (120 mg/kg). All groups beside the control were intragastrically administered once a day for 10 days and the volume of gastric perfusion was 0.2 ml/10 g. A model of alcoholic liver injury was established by intragastric administration of 35 degree Erguotou white wine 16 ml/kg after 30mins. After 10 days, the liver, spleen coefficient were observed, serum alanine aminotransferase (ALT), aspartate aminotransferase (AST), liver tissue superoxide dismutase (SOD) activity, glutathione peroxidase (GSH) activity, and malondialdehyde (MDA), nitric oxide (NO) levels were detected. Histopathological changes in liver tissue were also examined by HE staining.UDCA could reduce the spleen coefficient, serum ALT, AST activity, increase the activity of SOD and GSH in liver and decrease the contents of MDA and NO in liver tissue (< 0.05 or< 0.01).UDCA extract has a protective effect on alcoholic liver injury in mice.

ursodeoxycholic acid; alcoholic liver injury; mice

1674-8085(2018)05-0103-04

R965

A

10.3969/j.issn.1674-8085.2018.05.020

2018-05-07；

2018-08-06

福建省卫计委青年科研计划项目（2016-02-80）；福建省中青年教师教育科研项目（JT180653）

*尤梅桂(1988-05)，女，福建泉州人，助理实验师，硕士，主要从事药理实验教学工作(E-mail:1131785628@qq.com);

吴雅茗(1980-07)，女，福建晋江人，讲师，硕士，主要从事药理学和药学服务研究(E-mail: wy0511@163.com);

许雅苹(1987-05)，女，福建厦门人，讲师，博士，主要从事肿瘤微环境研究(E-mail: yapingxu13@163.com).