无创产前基因筛查在单双胎中的应用研究

2018-12-28彭海山黄华洁杨洁霞侯亚萍郭芳芳齐一鸣罗晓辉王东梅王奕霞尹爱华

中国产前诊断杂志(电子版) 2018年3期

彭海山黄华洁杨洁霞侯亚萍郭芳芳齐一鸣罗晓辉王东梅王奕霞尹爱华

(广东省妇幼保健院医学遗传中心，广东广州 511442)

近年来，由于人们生育时间的推迟以及辅助生殖技术的发展，辅助生殖成为受孕困难患者的首要选择，而促排卵药物的使用导致越来越多的双胎妊娠甚至是多胎妊娠发生[1-4]。与单胎妊娠相比，双胎妊娠的染色体非整倍体发生率更高且筛查工作更为复杂，集中在双胎的合子性质对筛查的影响以及双胎更容易发生有创产前诊断的并发症等方面[1, 3, 4]。因此，急需一项创伤性小且准确有效的筛查手段解决双胎妊娠的产前筛查需求。

无创产前基因筛查因其筛查的高效准确且创伤性小无并发症等优点，在临床上受到了广泛的关注和应用[5]。目前，已有许多文献报道无创产前基因筛查在单胎妊娠人群中有着很高的检出率与准确性，且许多专家学者也提出了其方法的可扩展性。国内外已有将无创产前基因筛查应用于双胎染色体非整倍体的筛查可能性的研究，但目前数据积累较少，仍需进一步证据支持。本文就广东地区双胎与单胎应用NIPT进行染色体非整倍体筛查进行对比研究，旨在为NIPT的双胎筛查增加研究数据的支持。

1 资料和方法

1.1 研究方案和对象选择2015年1月至2017年7月于本院产检并自愿接受NIPT的孕妇双胎妊娠442例，单胎妊娠15 206例。纳入标准：①孕周12周以上；②孕妇体重100kg以下；③夫妻染色体未发现明显异常者；④近一年内未接受过异体输血，细胞治疗，免疫治疗及无移植手术者。双胎妊娠孕妇年龄为16～48岁，孕周12～33周。单胎妊娠孕妇年龄为16～50岁，孕周12～38周。所有孕妇均充分告知了NIPT的临床适应证和局限性，并签署了知情同意书且本研究通过广东省妇幼保健院伦理委员会的批准。

1.2 方法

1.2.1 样本采集抽取孕妇外周静脉血8ml置于EDTA抗凝管中，8小时内分离血浆后分装保存于-80℃冰箱。

1.2.2 NIPT流程及数据分析使用博奥晶芯胎儿染色体非整倍体检测试剂盒提取血浆游离DNA及制备文库，使用ION Proton(life technology, America)平台高通量测序。测序结果经生物信息学处理后通过Z-score值来判断某条染色体是否有拷贝数的异常，主要判断标准为：当Z≥3时，结果提示为三体高风险；当-3

1.2.3 结果验证 NIPT结果提示低风险的孕妇定期常规产检；提示为高风险的孕妇，建议进一步行羊水或脐血穿刺，通过染色体核型分析结果检验NIPT结果的准确性。

1.2.4 妊娠结局随访打电话对所有孕妇妊娠结局追踪随访或查阅本院电子病历，包括孕期超声筛查结果、妊娠结局、新生儿体检的外貌、结构、智力发育等。

1.3 统计分析应用SPSS20.0统计软件进行统计学分析，计数资料采用率表示，计算NIPT的灵敏度，特异度，阳性预测值，阴性预测值。计数资料比较采用χ2检验，P<0.05。

2 结果

2.1 单双胎妊娠孕妇信息除去临床信息不全和失访病例，共收集单胎孕妇15 206例，双胎孕妇442例，具体信息见表1。单胎与双胎在年龄和孕周分布上无差别，χ2分别为9.655和4.51，P分别为0.086和0.341。高龄所占比例分别为35.14%和38.91%，P=0.101。然而，在单胎妊娠孕妇中，通过IVF方式获得胎儿的仅占4.14%，双胎中将近一半的受孕方式是IVF。且双胎中大部分是双合子双胎。

表1 单双胎孕妇基本信息

2.2 双胎妊娠孕妇NIPT结果及核型结果 442例自愿进行NIPT的双胎妊娠孕妇中，共检出高风险3例。3例高风险孕妇均选择进一步有创产前诊断，经染色体核型分析，其中1例21-三体高风险，结果确诊为47，XN,+21；2例18-三体高风险，一例确诊为47，XN，+18，后行选择性减胎术，另一例结果为46，XN，选择继续妊娠。具体情况见表2。

表2 双胎妊娠无创检测异常与产前诊断结果比较

2.3 NIPT对单双胎妊娠筛查效能比较 15 206例单胎妊娠孕妇中，NIPT高风险选择进一步行产前诊断者共81例，其中经染色体核型分析确诊共65例。双胎3例高风险中确诊2例。在对单胎妊娠低风险孕妇的随访中，发现1例18-三体假阴性病例，后经染色体核型确定为18-三体嵌合。双胎妊娠低风险孕妇随访未发现异常。比较NIPT在单胎和双胎中的筛查效能，具体情况见表3。

表3 单双胎NIPT检测效能比较

3 讨论

染色体非整倍体是缺陷儿出生的主要原因，21、18、13及性染色体三体综合征是最常见的染色体非整倍体[2]。虽然我国从2001年开始实施出生缺陷干预工程，但出生缺陷率仍高达5.6%，出生缺陷人数每年新增约90万人。大多出生缺陷无有效治疗手段，通过产前筛查和产前诊断进行出生缺陷的预防和干预是降低出生缺陷率最有效的手段[6]。由于受生活方式改变和环境等多因素影响，不孕症患者逐渐增多，辅助生殖技术帮助了许多不孕症患者的同时也使得双胎和多胎妊娠发生率明显增加。本研究显示双胎中接受辅助生殖技术的比例明显高于单胎妊娠，大约51.58%左右的双胎是通过IVF方式受孕，而单胎妊娠中IVF的比例只占到了4.14%(表1)。自然状态下，双胎发生率约1/90，而目前我国双胎妊娠发生率可达2%[7]。有研究表明，相对于单胎，双胎妊娠胎儿异常的发生率更高，且双胎的染色体非整倍体产前筛查更为复杂，主要表现在传统血清学筛查对双胎的检出率更低，假阳性率更高，而双胎妊娠进行有创产前诊断时更容易导致流产早产，需要承担更大的风险[2, 8, 9]。因此，对于双胎妊娠，迫切需要一项安全且有效的筛查方式。

随着胎儿游离DNA理论的提出和高通量测序技术的发展，实现无创性的产前筛查成为可能。同时，由于该项技术无创、安全、高效，很快得到了广泛的应用，已有许多数据表明在单胎妊娠孕妇中，NIPT有着优秀的检测效果，但双胎数据较少[9]。虽然有证据表明NIPT在双胎筛查中对21-三体的筛查效能较高，有潜在的应用价值[10, 11]，但仍需要进一步的数据积累证明，目前指南中双胎仍是慎用人群。本研究收集了442例行NIPT的双胎孕妇，共检测出1例T21、2例T18。经有创产前诊断结果证实21-三体全部可被识别，18-三体有1例被正确识别，T21、T18的灵敏度均为100%，且该两例正确识别孕妇的胎儿情况均为一胎染色体异常，另一胎正常。本研究中T21的阳性预测值可达100%，T18阳性预测值为50%，由于未检出13-三体，其阳性预测值不可得。对比于单胎21、18、13的检测结果，T21阳性预测值89.66%，T18阳性预测值75%，T13阳性预测值36.36%，双胎的检测效能与单胎类似，对21-三体的筛查效果比18-三体高，说明NIPT在双胎染色体非整倍体筛查中有一定的应用价值。

虽然NIPT在双胎妊娠中有一定的应用价值，但是不可否认，相对于单胎而言，NIPT应用于双胎需要更慎重。鉴于NIPT的检测原理，其结果的准确性与胎儿游离DNA的浓度即胎儿分数是密切相关的。未对胎儿浓度进行讨论是本研究的不足之处。对于单胎，检测要求胎儿游离DNA达到4%以上才符合检测标准，否则可能检测不到胎儿染色体异常，造成假阴性。而双胎由于合子性质的影响，更为复杂。单合子双胎由于由一个受精卵分裂而来，绝大部分的单合子双胎所含的遗传物质相同，可等同于单胎。双合子双胎则有着不同的遗传物质，是两个独立的胎儿，且有研究表明，在两个遗传物质不同的双胎中，两个双胎对胎儿游离DNA的贡献量是不同的，甚至可以达到2倍的差异[12]。在双合子双胎中，常常存在一胎正常而另一胎异常的情况，通常正常胎儿贡献的游离DNA量比异常胎儿的高，这样就容易造成即使总体胎儿浓度分数达到检测要求也可能由于异常胎儿游离DNA量不足导致假阴性的发生。为了防止此情况的发生，有部分研究采用了释放较少DNA的一胎的胎儿浓度分数进行结果判读分析，但此方法由于胎儿浓度变低，可导致检测失败率增加[13]。因此，NIPT在双胎妊娠中应用如何增加检测成功率的同时又能够最大程度避免假阴性结果的可能是将来研究的方向。