丹参胚性愈伤组织的诱导和细胞大量培养体系的建立

汪海霞，刘艳军，杨静慧，张般般，桂 毓，张景新

（1.天津市林业调查规划设计院，天津 300112；2.天津农学院 园艺园林学院，天津 300384；3.天津市蓟州林业局，天津 301900）

丹参（Salvia miltiorrhiza）以干燥根及根茎入药，是我国传统大宗药材，具有祛瘀止痛，活血通经，清心除烦之功效。临床上用于月经不调，经闭痛经，胸腹刺痛，热痹疼痛，疮疡肿痛，心烦不眠，肝脾肿大，心绞痛等。自20世纪70年代以来，临床上主要用于治疗冠心病、心绞痛、心肌梗塞等。由于大量采挖和生态环境的改变，野生丹参资源逐渐减少，远远不能满足人们的需求。因此，临床上常以人工栽培丹参替代野生丹参。但是，由于长期的人工栽培和在生产中的只种不选，使丹参生产出现品种退化、品种混杂等现象，致使丹参药材的产量和质量下降。利用组织培养技术可以改良丹参品种、提高其品质和产量，特别是利用细胞、器官组织培养方法可以直接获得丹参的有效成分，降低成本、提高效率。所以，组织培养技术是目前解决丹参栽培中面临的诸多问题和进行质量控制的有效途径[1]。

近年来，有关丹参组培研究的报道越来越多，赵东利等[2-8]比较了不同外植体和不同培养基的丹参快繁技术，认为B5培养基上丹参萌发腋芽和产生丛生芽的比例较高，效果较好；若以叶为外植体则以MS为基本培养基时诱导的丛生芽最快，可以达到快速繁殖的目的。蔡朝晖等[9-10]在组织培养条件下通过培养基上添加10～50 ppm的秋水仙碱，诱发出了丹参4倍体。该4倍体植株不仅表现出了多倍体植株各个器官变大的典型特征，而且主要化学成分含量亦高于对照。为丹参药材的优质、高产育种奠定了基础。

人工栽培丹参是为了获取其作为中药的药用物质或成分。丹参人工种植需要耗费大量的人力、物力，需要大量的土地和精细的土、肥、水管理。收获后还需要进一步加工、贮存或提取有效成分。然而，利用植物组织培养技术，可以免去田间生产环节，可以节省土地、降低成本，提高效率；可以直接生产丹参的有效成分、次级代谢产物，具有生产效率高、周期短、有效成分高等优点。胡月红等[11-13]研究发现通过组织培养获得的丹参愈伤组织中含有活性成分原儿茶醛和多种二萜醌类化合物。有日本学者通过组织培养技术在固定培养基上建立了6个丹参细胞系，其中有1个细胞系(A)可产生两种萜类物质隐丹参酮和铁锈醇 。有人利用农杆菌介导的转化组织和器官培养生产丹参活性成分。Hu等[14-16]用不同发根农杆菌菌株感染丹参无菌苗，获得的毛状根株系；分析显示其毛状根中和培养基里均含有7种丹参酮和铁锈醇成分；毛状根株系在不含铵盐的MS培养基上培养后，细胞中的总丹参酮含量大于43 mg·g-1干重，隐丹参酮含量为20 mg·g-1干重。所以，通过丹参愈伤组织的培养获得其有效成分的方法是可行的。

胚性愈伤组织是由一些生理代谢十分活跃的细胞组成，这类细胞的基因表达都处于较高水平，包括一些与药物成分合成相关的基因也更容易启动和大量表达，从而获得更多的药物有效成分[17]。其次，胚性愈伤组织生长速度较快，可以在短时间内生产出更多的药物[18]。第三，胚性愈伤组织不容易衰老，不会随着培养时间的增长，生长速度和药物合成速率下降[19]。

因此，通过胚性愈伤组织的培养，找到丹参药用成分大量合成的诱导条件，可以达到有目的、高效生产其药用成分的目的。另外，本研究还可以为丹参的单细胞诱变育种提供大量的试材，因胚性愈伤组织更易于产生变异，并且一旦获得细胞突变容易获得再生芽，从而提高诱变效率。

1 材料和方法

1.1 试验材料

本试验所用的丹参种子由园林植物实验室提供。

1.2 试验方法

1.2.1 丹参无菌苗的培养 选取饱满、表面光滑的丹参种子在70%的酒精中浸湿30 s，除去酒精后，将种子在40%的安替福民水溶液中消毒处理10 min（期间要不断摇晃盛有消毒液的三角瓶，使药剂与种子充分接触），再将种子用无菌水冲洗3次，每次清洗10 min。最后将消毒后的种子播种在MS培养基上，并放在光照强度为2 000 Lux，25 ℃温度条件下培养。30 d后当幼苗长到3 cm高时用其外植体诱导愈伤组织。

1.2.2 丹参不同外植体愈伤组织的诱导差异比较分别以丹参无菌苗的叶片、根和茎段为外植体，叶片边缘剪切形成伤口，根与茎段剪切成段，接种到MS+1.0 mg·L-12,4-D+30 g·L-1蔗糖的培养基上进行愈伤组织的诱导。每瓶接种6～8块外植体，每处理5个重复。每14 d继代1次，并在继代转移过程中剔除褐变、稀软的、生长速度慢的愈伤组织，保留生长速度快，外观松散、质地较硬的黄绿色愈伤组织。培养条件为：温度23～25 ℃，24 h光照，光照强度为1 000～2 000 Lux。接种后放到培养室中培养，每3 d观察1次，并记录愈伤组织生长情况。

愈伤组织诱导率/%=形成愈伤组织的外植体块数/接种外植体块数×100%

1.2.3 激素对丹参胚性愈伤组织生长的影响 将上述诱导出的丹参愈伤组织转移到含有不同激素的培养基上进行胚性愈伤组织的诱导。取上述愈伤组织，并切割成直径为3 mm的小块，转移到含有不同激素配比的培养基上。每瓶接种6块外植体，重复5次。培养基为MS培养基，添加7.0 g·L-1琼脂粉和30 g·L-1蔗糖，pH值调节到5.8。培养条件为：每个处理做5个三角瓶。在温度25 ℃、24 h光照、2 500 Lux光强下培养。每3 d观察1次，并记录愈伤组织生长情况。

2 结果与分析

2.1 丹参不同外植体愈伤组织的生长比较

丹参不同外植体在MS+1.0 mg·L-12,4-D+30 g·L-1蔗糖的培养基上培养10 d后，在外植体的伤口部位即形成愈伤组织。培养30 d后，不同外植体上的愈伤组织明显不同，具体情况见表1。

表1 丹参不同外植体愈伤组织的生长比较

从表1可以看出，不同外植体诱导的愈伤组织数量和质量均明显不同。其中，70%的叶片形成了愈伤组织，100%的茎和根段均形成了愈伤组织。说明丹参容易形成愈伤组织。丹参叶片形成愈伤组织相对困难，与其中分生组织较少有关。丹参的茎段中有维管形成层和木栓形成层等愈伤组织；根段中除了上述两种愈伤组织外，还有顶端分生组织。因此，根系和茎段更容易形成愈伤组织。

从诱导出的愈伤组织质量来看，从叶片与茎段诱导出的愈伤组织质地较硬，愈伤组织形成的数量较少，生长缓慢，主要以白色或淡黄色的愈伤组织为主，这类愈伤组织一般容易随着培养时间的增加而老化，内部褐变并木栓化，无法用于细胞药用物质的生产（图1）。但是，从根部伤口处诱导出的愈伤组织质地松散、多为黄绿色，细胞数量多、生长旺盛。因此，选择根系作为丹参愈伤组织药用成分培养的外植体。

2.2 激素对丹参胚性愈伤组织生长的影响

将上述丹参根系获得的松散型愈伤组织切下，转移到含有不同激素的培养基中诱导胚性愈伤组织。培养42 d后（每14 d继代1次，在继代时将生长缓慢、褐变的愈伤组织舍弃，保留结构松散、质地较硬的愈伤组织），不同处理下的愈伤组织的形态和生长速率都出现了差异。结果见表2。

表2 激素对丹参胚性愈伤组织生长的影响

从表2可以看出，在2,4-D浓度不变的情况下，增加BA的浓度（配方1～配方4），愈伤组织的生长速度从快变慢，质地也从松散逐渐变得紧密，愈伤组织颜色由白色逐渐变绿，最终变成完全绿色、细胞排列紧密型的愈伤组织（图1）。高BA浓度培养下的愈伤组织表面细胞分化生长正常，但是内部已经木栓化，且生长的细胞多数分化出了厚壁组织、导管等，无法形成胚性细胞。其次，在BA浓度不变，增加2,4-D的用量时（配方7～配方9），结果正好与上述相反。随着2,4-D浓度的增加，愈伤组织生长速度加快，质地变得松散，但细胞多为个体较大的薄壁细胞，愈伤组织中胚性化细胞——胚性愈伤组织较少，并随着2,4-D浓度增大，细胞个体增大，细胞中细胞质含量减少、液泡增大。因此，只有在适当的BA与2,4-D配比时才能诱导出松散型的胚性愈伤组织（图1）。因此，综上所述，诱导丹参松散型胚性愈伤组织的最佳培养基配方为：MS+0.5 mg·L-1BA+0.5 mg·L-12,4-D+30 g·L-1蔗糖。

图1 不同类型愈伤组织的形态

2.3 继代培养中激素对丹参松散型胚性愈伤组织生长的影响

将上述诱导出的丹参松散型胚性愈伤组织接种到含有不同激素组合的培养基上继续培养，培养30 d后发现其生长和形态特征都出现了较大的差异。具体结果见表3。

表3 继代培养中激素对丹参松散型胚性愈伤组织生长的影响

从表3可以看出，单独使用BA或2,4-D时，愈伤组织生长速度会减慢，同时胚性细胞也变成薄壁细胞或进行分化的成熟细胞（配方5和配方6）。因此，必须进行BA与2,4-D配合使用才能保持愈伤组织的胚性特性。当增大BA与2,4-D二者的浓度时，愈伤组织既可以保持胚性特性又可以增加生长速度（配方1～配方2）。但是，当激素浓度超过1.0 mg·L-1时，愈伤组织胚性特性逐渐消失（配方3和配方4）。因此，配方2中1.0 mg·L-1BA+1.0 mg·L-12,4-D的激素组合的继代培养效果最好，表现出愈伤组织生长快，愈伤组织始终保持为松散型、淡绿色、细胞较小、分裂旺盛的胚性愈伤组织。这样的经过长期培养形成的大量的愈伤组织，才可能含有较高的药用成分。综合上述试验结果，本试验确定的丹参松散型胚性愈伤组织继代培养的快速生长的理想培养基配方为：MS+1.0 mg·L-1BA+1.0 mg·L-12,4-D+30 g·L-1蔗糖。

3 讨 论

3.1 外植体类型对不同类型愈伤组织的诱导的影响

在进行愈伤组织诱导过程中，外植体的选择对于愈伤组织诱导效果影响很大。一般来说。分生组织较多的外植体容易诱导出愈伤组织如茎尖和根尖。愈伤组织一般生长速度主要决定于愈伤组织中分生组织的生长速度，但也受到培养基中渗透压的影响。含有较多分生组织的外植体除了可以很快诱导出愈伤组织外，还会影响愈伤组织的质地与结构，含有较多分生组织的外植体诱导出的愈伤组织一般为质地较硬的紧密型愈伤组织，这类组织在正常培养条件下不能产生松散型的愈伤组织，多数最终只是在愈伤组织块的外部形成一层具有生理功能的细胞层，即使分裂也是少数细胞能够分裂出胚性化细胞，效率较低。相反，含有较少分生组织的外植体如叶片，由于内部处于分化的细胞较少，愈伤组织在一般条件下不容易诱导出来，当降低培养基的渗透压时，一些成熟组织的细胞会吸水膨胀发育为巨大型薄壁细胞，在短时间内这些细胞均不能发育为较多的愈伤组织细胞。因此，这类愈伤组织一般质地过于柔软，在短时间内不能获得质地较硬的松散型愈伤组织，必须经过一段时间的培养与诱导才能逐渐转变为松散型愈伤组织，继而发育成松散型胚性愈伤组织。这类愈伤组织在体细胞诱变育种及其它细胞学研究中用途很多。所以，根据试验目的不同，在进行愈伤组织诱导中适宜的外植体选择是决定愈伤组织类型的关键。

3.2 2,4-D在愈伤组织培养中的主要作用

2,4-D对于愈伤组织的诱导作用很大，很多植物在缺少2,4-D的情况是无法诱导出胚性愈伤组织的。这是因为，一是2,4-D可以诱导成熟的细胞转变为薄壁细胞，即有脱分化的作用；二是2,4-D可以使细胞快速生长，尤其是一些通过分生组织诱导出的质地较硬的愈伤组织，这些愈伤组织如果没有2,4-D存在，很容易停止生长，老化或分化成一些成熟组织；第三，2,4-D可以抑制愈伤组织的分化，尤其是抑制器官的分化。在2,4-D存在的情况下，愈伤组织很难分化出根或不定芽，对愈伤组织胚性化也产生一定的抑制作用。本研究的目的是不断地进行愈伤组织的培养，通过形成大量的愈伤组织来生产丹参的药用物质。所以，保持愈伤组织的旺盛生长是本研究的关键。

3.3 愈伤组织继代培养中细胞胚性特征的保持

胚性愈伤组织生长更快，细胞分裂更多，细胞的生理状态相对稳定。在药用植物生产中需要通过继代培养保持愈伤组织的胚性。要想在多次继代后愈伤组织仍然保持一定的胚性，就必须在培养基中保持细胞分裂素与生长素在适当的比例，当二者达到一种平衡状态后，愈伤组织就会维持其自身的胚性特性，同时又会保持其快速分裂的愈伤组织的特性。

然而，不同愈伤组织需要不同的激素种类与浓度配比，这在实际操作中必须进行反复试验，并根据生长情况做出相应的改变。除了培养基中激素的平衡，还需要注意愈伤组织培养的条件变化。一般认为低温对于愈伤组织胚性的保持起到一定的效果。此外，光照强度也有影响，强度过高会导致愈伤组织分化，过低会使愈伤组织失去胚性。最后，继代时也要注意转接愈伤组织团的大小与愈伤组织的质地变化，要适当做出相应的调整。

4 结 论

本试验通过对丹参胚性愈伤组织的诱导，建立了一套高效的丹参胚性愈伤组织培养体系，具体归纳为以下步骤：采用丹参试管苗的根为外植体，在MS+1.0 mg·L-12,4-D+30 g·L-1蔗糖的培养基上可以诱导出理想的松散型愈伤组织；在MS+0.5 mg·L-1BA+0.5 mg·L-12,4-D+30 g·L-1蔗糖的培养基上，经过3～5次继代培养可以诱导出胚性愈伤组织；在MS+1.0 mg·L-1BA+1.0 mg·L-12,4-D+30 g·L-1蔗糖的培养基上，丹参的胚性愈伤组织生长速度最快。本试验结果将为丹参的体细胞诱变育种和生物制药研究奠定了基础。