凋亡相关蛋白SMAC的表达与非小细胞肺癌患者临床特征及预后的关系△

陈康，艾孜子·阿不来提，王小雷

新疆维吾尔自治区人民医院胸外科，乌鲁木齐830000

肺癌在全球具有较高的发病率，其病死率在中国居恶性肿瘤首位，非小细胞肺癌是肺癌中最常见的一种类型。肺癌的发生、发展、预后与多种因素有关，但受限于患者的个体差异，即便是同一病理类型，接受相同化疗方案的患者，其生存期也不尽相同。因此，寻找一种与非小细胞肺癌的发生、发展、预后密切相关的生物因子进行有效治疗是十分必要的[1]。随着人们对非小细胞肺癌发生、发展、预后等认知的加深，有学者提出细胞凋亡缺陷或受阻是肿瘤发生和发展中的一个重要因素[2]。第二个线粒体衍生的半胱天冬酶激活蛋白（second mitochondrial activator of caspase，SMAC）是近年来发现的线粒体膜间隙蛋白，该蛋白被证实具有调节细胞凋亡的功效，且在正常细胞中不会引起凋亡[3]。当细胞受到凋亡刺激时，SMAC会从线粒体中释放到细胞质中，与凋亡抑制蛋白（inhibi-tor of apoptosis protein，IAP）结合后，通过去除IAP对半胱氨酸蛋白酶（cysteinyl aspartate specific proteinase，caspase）的抑制作用，从而促进细胞凋亡[4]。本研究通过免疫组化法检测非小细胞肺癌组织和癌周肺组织中SMAC的表达情况，旨在探讨SMAC蛋白表达与非小细胞肺癌临床特征和预后的关系。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选取2013年2月至2014年2月于新疆维吾尔自治区人民医院手术的67例非小细胞肺癌患者的非小细胞肺癌组织标本。纳入标准：①均经病理学诊断确诊为非小细胞肺癌；②无其他器官和系统器质性病变；③无自身免疫性疾病或严重基础性疾病；④术前未接受放疗、化疗及靶向治疗等；⑤术后均采用统一的治疗方案；⑥年龄50～70岁；⑦配合生存期等资料的收集工作。排除标准：①术前接受放疗、化疗或靶向治疗；②合并自身免疫性疾病或严重的基础疾病；③年龄＞70岁或＜50岁；④不能配合接受调查随访。67例非小细胞肺癌患者中，男性44例，女性23例；年龄50～70岁，中位年龄63岁；肿瘤直径≥3 cm 43例，肿瘤直径＜3 cm 24例；鳞癌30例，腺癌37例；TNM分期：I期8例，Ⅱ期12例，Ⅲ期25例，Ⅳ期22例。另外，选取本组67例非小细胞肺癌患者的癌周肺组织作为研究参照。全部标本均于10%的福尔马林溶液固定和石蜡包埋处理。以电话查询和复诊记录对患者进行为期3年的调查随访，以手术日期为随访起始时间，每隔6个月对患者进行1次电话随访，2017年2月为随访终止时间，本研究经医院伦理委员会批准同意，所有患者均对本研究知情同意并签署知情同意书。

1.2 主要仪器与试剂

KD-2850低温恒冷切片机购自浙江省金华市科迪仪器设备有限公司，显微镜购自日本奥林巴斯株式会社，电热恒温箱购自杭州艾普仪器设备有限公司，电磁炉购自东莞菱戈兰电子科技有限公司，精密电子天平购自瑞士梅特勒-托利多集团；SMAC鼠抗人单克隆抗体购自美国Cell Signaling Biotechnology公司，通用型免疫组织化学试剂盒及显色剂均购自基因科技（上海）有限公司，无水乙醇购自上海东羿化工有限公司，苏木素购自天津市赛瑞达生物工程有限公司，盐酸购自济宁汶上县长浩商贸有限公司，二甲苯购自青岛锦鹏化工有限公司，氯化钠购自廊坊鹏彩精细化工有限公司，磷酸氢二钠、枸橼酸钠均购自南京化学试剂股份有限公司，中性树脂购自北京益利精细化学品有限公司。

1.3 实验方法

组织标本解冻，制成石蜡切片，厚度4 μm，进行SMAC的免疫组织化学法（Elivision）染色；60℃加热切片4 h，之后经二甲苯脱蜡和自来水冲洗2～3 min；抗原修复：500 ml乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）抗原修复液（pH=9.0）中将切片持续加热20 min，室温条件下自然冷却；取出切片，分别用蒸馏水和磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS）漂洗2～3次；3%过氧化氢去离子水中浸泡10 min，再次PBS漂洗5 min；纱布擦干标本切片，滴加SMAC鼠抗人单克隆抗体（1∶400），孵育60 min，PBS冲洗；滴加PV-9000免疫组化试剂盒中的增强剂，于28℃条件下孵育60 min，PBS冲洗；滴加PV-9000免疫组化试剂盒中二抗，孵育60 min，PBS冲洗；加入DAB显色液，待显微镜下观察着色后，用去离子水冲洗，终止染色；苏木素染色，流水反蓝15 min；乙醇脱水后，二甲苯中浸泡，自然风干；中性树脂封片，400×高倍镜下观察。

1.4 免疫组织化学法染色结果判定[5-6]

SMAC蛋白免疫组织化学法染色为黄色或棕黄色颗粒，表达于细胞质中。染色强度和阳性细胞所占比例由两名病理科医师进行综合评定，分别在显微镜下选取5个高倍视野，记录染色强度和阳性细胞所占比例。染色强度：无着色记为0分，浅黄色记为1分，棕黄色记为2分，棕褐色记为3分；阳性细胞所占比例：无阳性细胞记为0分，阳性细胞所占比例＜1%记为1分，阳性细胞所占比例为1%～10%记为2分，阳性细胞所占比例为11%～33%记为3分，阳性细胞所占比例为34%～67%记为4分，阳性细胞所占比例为68%～100%记为5分。最终评分为阳性细胞所占比例得分与染色强度得分的总和：0～2分为阴性（-），3～4分为弱阳性（+），5～6分为中等阳性（++），7～10分为强阳性（+++）；其中（-～++）为低表达，（+++）为高表达。

1.5 统计学分析

采用SPSS 18.0软件对数据进行分析。计数资料以例数和率（%）表示，组间比较采用χ2检验；计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t检验；采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线，生存率的比较采用Log-rank检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SMAC表达水平的比较

肺癌组织中SMAC阳性表达50例，阳性表达率为74.6%（50/67），其中SMAC高表达18例，SMAC低表达49例；癌周肺组织中SMAC阳性表达39例，阳性表达率为58.2%（39/67）。肺癌组织中SMAC的阳性表达率高于癌周肺组织，差异有统计学意义（χ2=4.048，P=0.044）。（表1）

表1 SMAC蛋白在不同组织中的表达情况

2.2 SMAC蛋白表达与非小细胞肺癌患者临床特征的关系

TNM分期为Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴结转移的非小细胞肺癌患者肺癌组织中SMAC的阳性表达率分别高于TNM分期为I～Ⅱ期、无淋巴结转移的患者，差异均有统计学意义（P＜0.05）；不同年龄、性别、吸烟史、组织分化程度、肿瘤直径、组织类型和肿瘤位置的非小细胞肺癌患者肺癌组织中SMAC的阳性表达率比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。（表2）

表2 不同临床特征非小细胞肺癌患者肺癌组织中SMAC蛋白表达情况的比较（ n=67）

2.3 生存情况的比较

对患者进行为期3年的随访，中位随访时间为18个月，随访结果显示：SMAC低表达患者的中位生存期为15.6个月（95%CI：13.68～16.92），3年生存率为36.7%；SMAC高表达患者的中位生存期为13.9个月（95%CI：10.65～14.31），3年生存率为33.3%。Log-rank检验结果显示，SMAC低表达与SMAC高表达患者的3年生存率比较，差异无统计学意义（χ2=0.066，P=0.797）。（图1）

图1 SMAC低表达（ n=49）与SMAC高表达（ n=18）患者的生存曲线

3 讨论

肺癌具有极高的发病率和病死率，中国每年因肺癌死亡的人数较多且在逐年增高，目前肺癌已经成为全球范围内亟待攻克的重点和难点问题[7]。临床治疗肺癌主要包括手术治疗、化疗、放疗、靶向治疗等方法，其中手术治疗的效果最佳，但超过50%的患者在确诊时已经失去了手术切除的机会。化疗是延长晚期肺癌患者生存时间的主要手段，但化疗效果容易受肿瘤异质性和化疗耐药性的影响，使得化疗效果的个体差异较大，为了避免联合化疗或大剂量化疗给患者正常组织细胞造成的不必要损伤，临床上亟需寻找新的抗肿瘤靶点，开发肿瘤特异性化疗药物。细胞凋亡调控是近年来抗肿瘤药物研发的重点领域，细胞凋亡是指由基因控制的细胞自主性程序死亡。细胞凋亡具有维持机体发育分化和内环境稳定的重要作用。一旦细胞凋亡系统受到抑制便会引起细胞凋亡减少及细胞过度增殖，从而引起肿瘤的发生、发展[8]。SMAC是近年来发现的一种促凋亡蛋白，有研究认为SMAC蛋白是肿瘤基因治疗的潜在靶点，并通过实验证实SMAC蛋白具有增强肿瘤细胞对凋亡刺激敏感度的作用[9]。Fulda等[10]通过动物实验发现，SMAC可明显增加肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体诱导的肿瘤细胞凋亡，且对正常的组织细胞不具有细胞毒作用。蔡增琰[11]研究认为，SMAC蛋白的表达水平与胶质瘤的恶性程度呈负相关，并推测SMAC蛋白的表达可能影响胶质瘤的发生、发展。赵宝峰等[12]研究发现，SMAC蛋白高表达可以提高γ射线对宫颈癌HeLa细胞的生长抑制率，促进γ射线诱导的HeLa细胞的凋亡进程。因此，明确SMAC蛋白在肿瘤细胞中的特异性表达，可能有助于推进未来肿瘤基因诊断和治疗的研究进程。

SMAC是目前发现的存在于哺乳动物细胞内的可以直接抑制IAP的一种蛋白，其在人类睾丸中的表达水平最高，在肺部、脑部、胸腺中的表达水平较低[13]。SMAC基因由7个外显子组成，位于12号染色体长臂，转录后形成的SMAC蛋白共有184个氨基酸[14]。SMAC蛋白根据自身形态可以分为单体和二聚体，其中单体SMAC蛋白不具有促凋亡作用，二聚体SMAC又称野生型SMAC，位于线粒体膜间隙内，具有调节损伤细胞凋亡的功效。研究认为，SMAC的促凋亡机制与caspase分子有关，caspase在激活机体内细胞凋亡通路中起着核心作用，二聚体SMAC蛋白在细胞凋亡的早期可通过消除IAP家族成员对caspase 3、caspase 7、caspase 9的抑制，激活Procaspase和caspase的酶活性，引起caspase 3、caspase 7和caspase 9相继被激活并发生caspase的级联放大效应，从而起到促凋亡作用[15-16]。

本研究采用免疫组织化学法检测非小细胞肺癌患者肺癌组织和癌周肺组织标本中的SMAC表达情况，并分析其表达水平与非小细胞肺癌患者临床特征和预后的关系。结果发现，肺癌组织中SMAC的阳性表达率高于癌周肺组织，差异有统计学意义（P＜0.05），提示SMAC蛋白在肺癌组织中的表达水平高于癌周肺组织，SMAC阳性可用于非小细胞肺癌的辅助诊断；本研究结果显示，TNM分期为Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴结转移的非小细胞肺癌患者肺癌组织中SMAC的阳性表达率分别高于TNM分期为I～Ⅱ期、无淋巴结转移的患者（P＜0.05），但不同年龄、性别、吸烟史、组织分化程度、肿瘤直径、组织类型和肿瘤位置非小细胞肺癌患者肺癌组织中SMAC的阳性表达率比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。上述结果提示SMAC可能对非小细胞肺癌的发展起到促进作用。本研究结果看似有悖于常规的促凋亡理论，因为理论上SMAC高表达被认为是能促进肿瘤细胞凋亡和抑制肿瘤进展的，然而肿瘤恶性程度不断发展的过程中，其坏死组织也在不断增加，因此可以推测在非小细胞肺癌恶性程度逐渐增高的过程中，细胞凋亡活性可能会随着细胞增殖活性的增强而增强。本研究对SMAC蛋白表达与非小细胞肺癌患者预后关系的分析结果显示，SMAC蛋白低表达患者的3年生存率与SMAC蛋白高表达患者比较，差异无统计学意义（P＞0.05），提示SMAC不能作为非小细胞肺癌患者预后的独立影响因素。叶闻远等[17]同样在报道中指出，SMAC与非小细胞肺癌患者的预后无关。但因本研究中采用免疫组织化学法检测SMAC蛋白的表达水平，易受多种因素干扰，可能影响结果的准确性。同时，本研究样本量较少，后续研究中应扩大样本量，平衡各因素，完善研究方案。

综上所述，SMAC在肺癌组织中的表达水平高于癌旁组织，TNM分期为Ⅲ～Ⅳ期及有淋巴结转移的非小细胞肺癌患者肺癌组织中SMAC的阳性表达率分别高于TNM分期为I～Ⅱ期和无淋巴结转移的患者，因此进一步研究其在肺癌患者体内的表达规律变化可在一定程度上反映肺癌的发展情况，同时可作为肺癌的辅助诊断手段；但SMAC在肺癌发生、发展中发挥的生理作用及其机制有待进一步研究，以期开辟肿瘤治疗的新途径。