siRNA介导COX-2基因沉默对大肠癌LoVo细胞侵袭及上皮间质转化的影响

李 明， 谭诗云

武汉大学人民医院消化内科 消化系疾病湖北省重点实验室，湖北 武汉 430060

大肠癌是临床上常见的消化道恶性肿瘤，其死亡率高居肿瘤相关死亡的第2位[1-2]。肿瘤发生侵袭、转移是导致大肠癌患者临床治疗失败和死亡的主因，因此，探讨大肠癌侵袭、转移的相关机制具有重要意义。上皮细胞间叶样表型转化(epithelial to mesenchymal transition, EMT)是肿瘤原发性浸润和继发性转移的重要机制[3-4]。在包括大肠癌在内的多种肿瘤细胞中均过表达的环氧合酶-2(cyclooxygenase-2, COX-2)与肿瘤侵袭、转移密切相关，但COX-2表达对大肠癌细胞EMT的影响及其相关机制尚不十分明确，因此，本研究拟通过转染沉默COX-2小干扰RNA(small interfering RNA, siRNA)片段，观察下调COX-2表达后对大肠癌细胞侵袭能力、EMT的影响并探讨可能的机制，为大肠癌侵袭、转移及临床治疗提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1材料大肠癌细胞系LoVo细胞(中科院上海细胞库)；胎牛血清(GBICO)；DMEM/F-12培养基(美国Invitrogen公司)；转染试剂Lipofectamine 2000(Sigma公司)；Transwell小室、细胞培养瓶、细胞培养皿及6孔培养板(Corning公司)；Trizol、Matrigel胶、RT试剂盒(BD公司)；COX-2 siRNA(上海吉玛公司)(COX-2 siRNA正义链5′-GTATGACAACAGCCTCAAGT-3′，反义链5′-ACTTGAGGCTGTTGTCATAC-3′；COX-2阴性对照siRNA序列正义链5′-TTCTCCGAACGTGTCACGTT-3′，反义链5′-AACGTGACACGTTCGGAGAA-3′)；COX-2引物(南京金瑞斯生物科技有限公司)；逆转录试剂盒(Fermentas公司)；EMT标志物抗体(E-cadherin、Vimentin、Fibronectin)、ERK/MAPK和PI3K/Akt通路相关Akt、p-Akt、p-GSK-3β、ERK和p-ERK抗体、COX-2、MMP-9及内参β-actin抗体(美国Cell Signaling Technology公司)；蛋白浓度测定试剂盒、HRP-羊抗兔、HRP-羊抗鼠(杭州碧云天生物技术研究所)。

1.2方法

1.2.1 细胞培养：大肠癌LoVo细胞在37℃、体积分数为5%的CO2饱和湿度条件的恒温箱中，用质量浓度为100 g/L胎牛血清的DMEM/F12培养液培养。实验均选用处于对数生长期的细胞进行。

1.2.2 COX-2 siRNA转染：取对数生长期的细胞，接种于6孔培养板内，倒置显微镜下观察，当细胞融合度为50%左右时转染。用250 μl无双抗、无血清的DMEM/F12培养基分别与5 μl Lipofectamine 2000和5 μl siRNA混匀，再将二者液体混匀，加入细胞融合度为50%左右6孔板中，培养6 h后换质量浓度为100 g/L血清的培养基，继续培养24～72 h提取细胞mRNA及蛋白，检测转染效率，根据最佳转染时间点继续后续实验。

1.2.3 RT-PCR法检测COX-2表达：收集转染前后细胞，按Trizol试剂说明书一步法提取总RNA，分光光度计测定计算纯度和浓度，按RT试剂盒操作说明合成cDNA，并进行聚合酶链反应(PCR)。COX-2上游引物：5′-AATGAGTACCGAAAATTC-3′，下游引物：5′-CATCTAGTCCGGACCGGGAAG-3′，GAPDH上游引物：5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′，下游引物：5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′，GAPDH为内参。PCR反应条件：94 ℃ 4 min；94 ℃ 30 s，51 ℃ 30 s，72 ℃ 25 s；30个循环，72 ℃ 4 min。取5 μl PCR产物进行质量浓度为2 g/L琼脂糖凝胶电泳，紫外光下观察并拍照。将电泳完毕的琼脂糖凝胶置于Bisoens SC620凝胶成像系统拍照并分析，实验重复3次。

1.2.4 Transwell法检测细胞侵袭能力：取对数生长期的转染COX-2 siRNA前后的LoVo细胞，用不含血清的培养基重悬计数，接种200 μl 于24孔板Transwell小室上室(细胞密度为2×105ml-1)；将600 μl质量浓度为100 g/L血清的培养基加入24孔板Transwell小室下室，37 ℃、体积分数为5%CO2条件下培养24 h；小心取出小室，吸干小室内培养基，PBS洗涤3次，用PBS湿润的棉签轻轻拭小室内的细胞，倒置晾干，质量浓度为40 g/L多聚甲醛室温下放置固定30 min，倒置晾干，质量浓度为1 g/L结晶紫染液室温下染色15 min，显微镜下取5个随机视野计数，统计结果，实验重复3次。

1.2.5 免疫印迹法检测转染前后LoVo细胞EMT标志物、ERK/MAPK和PI3K/Akt通路相关蛋白及MMP-9表达的变化：消化收集细胞，加入200 μl预冷的含PMSF的蛋白裂解液，用移液器反复抽吸后震荡1 min，4 ℃条件下裂解30 min，4 ℃条件下12 000 r/min离心10 min(离心半径5.5 cm)，将上清液小心移至经高压消毒的EP管内，根据蛋白测定试剂盒说明书检测蛋白质浓度计算蛋白质含量；采用免疫印迹法检测蛋白质表达情况，简言之，取40 μg各组样品行SDS-PAGE电泳，再转膜至PVDF膜，质量浓度为50 g/L BSA封闭1 h，根据蛋白分子量切割条带，分别加入1∶1 000稀释的E-cadherin、Vimentin、Fibronectin、Akt、p-Akt、p-GSK-3β、ERK和p-ERK、COX-2、MMP-9及内参β-actin抗体，室温下孵育2 h，再次TBST洗膜，ECL显色及曝光，显影、定影，拍照并分析数据，实验重复3次。

2 结果

2.1COX-2siRNA转染后对LoVo细胞COX-2mRNA和蛋白表达的影响通过RT-PCR和Western blotting检测COX-2 siRNA转染LoVo细胞后COX-2 mRNA及蛋白来间接判断COX-2 siRNA是否成功转染到大肠癌LoVo细胞中。如图1所示，COX-2 siRNA转染LoVo细胞48 h后，LoVo细胞COX-2 mRNA及蛋白表达水平显著降低。

2.2COX-2siRNA转染后对LoVo细胞侵袭能力的影响COX-2 siRNA转染LoVo细胞48 h后，转染效率最高，因此检测转染48 h后Transwell实验结果所示，越过Transwell小室基底膜的细胞数逐渐减少，且MMP-9表达下调，表明COX-2 siRNA转染可抑制LoVo细胞侵袭能力(见图2)。

2.3COX-2siRNA对LoVo细胞EMT标志物蛋白表达的影响COX-2 siRNA转染LoVo细胞48 h后，Western blotting检测结果显示,上皮标记物E-钙黏素(E-cadherin)表达上调，而间叶标记物波形蛋白(Vimentin)和纤维连接蛋白(Fibronectin)表达下调(见图3)。

图1 RT-PCR和Western blotting检测转染COX-2 siRNA后对LoVo细胞COX-2 mRNA和蛋白表达的影响Fig 1 Effects of COX-2 siRNA transfection on expressions of COX-2 mRNA and proteins in LoVo cells detected by RT-PCR and Western blotting

图2COX-2siRNA转染对LoVo细胞侵袭能力的影响A：Tanswell小室检测COX-2 siRNA转染后LoVo细胞的侵袭能力；B：与对照siRNA转染组比较，COX-2 siRNA转染后LoVo细胞穿过人工基底膜的LoVo细胞数显著减少；C：COX-2 siRNA转染后LoVo细胞MMP-9表达下调

Fig2EffectofCOX-2siRNAtransfectiononinvasionabilityofLoVocellsA: Tanswell cells were used to detect the invasiveness of LoVo cells after transfection of COX-2 siRNA; B: compared with the control siRNA transfection group, the number of LoVo cells transfected with COX-2 siRNA was decreased significantly after transfection; C: down regulation of MMP-9 expression in LoVo cells after transfection of COX-2 siRNA

2.4COX-2siRNA对Akt、p-Akt、p-GSK-3β、ERK和p-ERK表达的影响肿瘤细胞EMT过程依赖信号通路包括ERK/MAPK和PI3K/Akt的激活，这些通路与细胞侵袭也密切相关，因此本实验进一步检测了转染COX-2 siRNA后LoVo细胞ERK和Akt表达水平的变化。结果如图4所示，转染COX-2 siRNA后LoVo细胞总的ERK水平无明显改变，而ERK磷酸化水平降低；细胞总的Akt表达量无变化，而p-Akt表达减少，同时，Akt下游效应蛋白p-GSK-3β表达也减少。

图3COX-2siRNA转染对LoVo细胞EMT标志物E-cad-herin、Vimentin及Fibronectin表达的影响

Fig3EffectsofCOX-2siRNAtransfectiononexpressionsofEMTmarkersE-cadherin,VimentinandFibronectininLoVocells

图4COX-2siRNA转染对LoVo细胞Akt、p-Akt、p-GSK-3β、ERK和p-ERK蛋白表达的影响

Fig4EffectsofCOX-2siRNAtransfectiononexpressionsofAkt,p-Akt,p-GSK-3β,ERKandp-ERKproteinsinLoVocells

3 讨论

COX-2是前列腺素(prostaglandins, PGs)特别是前列腺素E2(PGE2)合成过程的重要限速酶[5]。研究证实，COX-2在许多上皮性肿瘤如结直肠癌、非小细胞肺癌、胃癌、胰腺癌及头颈部肿瘤等肿瘤中过表达[6]，参与细胞恶性转化、抑制细胞凋亡、促进肿瘤血管新生、抑制抗肿瘤免疫等机制调控，并提示预后不良[7-8]。其在正常细胞中低水平表达或不表达，其差异性使其可能成为肿瘤治疗靶点。流行病学研究已经证实，非选择性COX抑制剂或选择性COX-2抑制剂在一定程度上可有效预防胃肠道肿瘤[9]。本实验结果显示，转染COX-2 siRNA后，LoVo细胞COX-2 mRNA及蛋白表达均下调，同时越过Transwell小室基底膜的细胞数逐渐减少，且MMP-9表达下调，表明COX-2 siRNA转染可下调COX-2表达，并抑制LoVo细胞侵袭能力。

研究证实，EMT是肿瘤原发性浸润和继发性转移的重要机制。EMT 是在胞外因素刺激下由上皮细胞表型转化为具有间质细胞表型的过程[10]。在EMT 过程中，细胞极性、细胞间紧密连接和黏附连接逐渐丧失，肌动蛋白细胞骨架发生重组，细胞-细胞间连接蛋白如E-cadherin、γ-catenin等表达减少，而间叶标记物如N-cadherin、Vimentin、Fibronctin 等表达明显增加；同时，基质金属蛋白酶(matrix metalloproteins, MMPs),如MMP-2、MMP-3 及MMP-9 等活性显著增加，细胞被转化为具有侵袭和运动能力的间叶样细胞表型。本实验中，COX-2 siRNA转染LoVo细胞48 h后，免疫印迹法检测细胞EMT标志物表达变化情况，结果显示，上皮标记物E-cadherin表达上调，同时间叶标记物Vimentin和Fibronectin表达下调，提示COX-2 siRNA转染后可抑制大肠癌LoVo细胞EMT。

在肿瘤细胞EMT过程中，ERK/MAPK和PI3K/Akt等通路的激活发挥着重要作用[11]。PI3K/Akt通路激活后既可通过上调细胞内核转录因子如Slug、Snail、Twist和ZEB等的表达，直接抑制细胞E-cadherin表达[12]，又可通过诱导基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)表达[13]，后者可降解E-cadherin，诱导EMT；ERK/MAPK通路的激活可直接或间接上调Vimentin 的表达，从而促进EMT的发生[14]。因此，本实验检测了COX-2 siRNA转染后LoVo细胞ERK和Akt表达水平的变化，结果显示，细胞总的ERK水平无明显改变，而ERK磷酸化水平降低；细胞总的Akt表达量无变化，而p-Akt表达减少，同时，Akt下游效应蛋白p-GSK-3β表达也减少，这些结果表明COX-2 siRNA转染后可抑制ERK/MAPK和PI3K/Akt通路的激活。

综上所述，本实验发现，siRNA干扰有效沉默了大肠癌LoVo细胞COX-2表达，可能通过抑制细胞ERK/MAPK和PI3K/Akt通路的激活，抑制EMT，下调MMP-9表达，最终降低细胞侵袭能力。