干扰素诱导跨膜蛋白2在胃癌预后中的作用及临床意义

邓 峰， 缪小丽

重庆三峡中心医院普外科，重庆 404000

胃癌在我国有着高发病率、高死亡率及低生存率的特点[1-2]，并且由于早期筛查手段的不健全，许多患者诊断出胃癌时已经是进展期[3]，从而使其成为严重危害人类健康的恶性肿瘤之一[4]。虽然胃癌的临床治疗手段在过去几年内有所发展，但其术后5年生存率依然无显著性提高[5-6]。因此，深入研究胃癌的发病机制及其预后的相关分子标志物对其预防和治疗有重要意义。干扰素诱导跨膜蛋白(IFITM)在多种肿瘤组织中表达，其家族的3个成员IFITM1、IFITM2、IFITM3都由11号染色体对应的18 kb的基因组编码，因此，具有高度同源性[7-8]；其中IFIT1和IFITM3在胃癌中的作用已被揭示[9-10]，但IFITM2与胃癌发展关系的研究尚少。所以，本研究主要探究IFITM2在胃癌中的作用及其与预后的关系。

1 资料与方法

1.1一般资料回顾性研究2010年6月至2012年6月在我院行手术治疗的103例胃癌患者，男68例，女35例，年龄(55.66±8.50)岁(29～72岁)，其中<60岁的患者有73例，≥60岁的患者有30例。肿瘤位于胃窦56例，胃体25例，贲门17例，胃底5例。所有患者术后组织病理学检查均证实为胃癌。术后对所有患者随访5年。

依据IFITM2在胃癌中的表达量分为：750～940 pg/ml(高表达)、579～749 pg/ml(中表达)、230～578 pg/ml(低表达)3个区段[8]，并研究这3个表达量区段与患者患者生存时间之间的关系。

1.2逆转录-聚合酶链反应(RT-qPCR)实验利用总RNA提取试剂盒(QIAGEN，74104)提取所有患者癌组织与癌旁组织的总RNA，并运用逆转录试剂盒(QIAGEN，210210)将总RNA逆转录为cDNA。设计IFITM2基因上游引物序列：5′-TGTGCAAACCTTCTCTCCTGT-3′；下游引物序列：5′-TGTGGATCACGGTGGACATC-3′，对照基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)上游引物序列：5′-AAATCCCATCACCATCTTCCAGG-3′；下游引物序列：5′-AGATGATGACCCTTTTGGCTCCC-3′。分别用上述引物于荧光定量PCR仪进行扩增，扩增体系20 μl：SYBR Green Master Mix(2X) 10 μl，cDNA 1 μl，上、下游引物均为1.5 μl，ddH2O 6 μl。反应条件： 95 ℃ 1 min，95 ℃ 10 s， 55 ℃ 15 s(循环数为35)。qPCR结果统计：ΔCt=Ct目的基因-CtGAPDH，ΔΔCt=ΔCt 处理组-ΔCt对照组，mRNA相对表达量=2-ΔΔCt。

1.3蛋白质免疫印迹(Westernblotting)实验按照产品说明书使用细胞膜和细胞核蛋白提取试剂盒(碧云天，P0033)提取总蛋白。取15 μg总蛋白上样, 70 v电泳1.5 h。电泳结束后依据Marker切下目的条带，并取与目的条带凝胶大小相同的PVDF膜和滤纸，依次放好后，150 mA，转膜90 min。转膜结束后用含质量浓度为50 g/L脱脂奶粉的TBST(封闭液)浸泡PVDF膜，室温摇床封闭1 h。然后孵育一抗，用封闭液稀释相应的IFITM2抗体(Santa Cruz；sc-373676；1∶1 000)， GAPDH抗体(碧云天，AF0006，1∶10 000)，将PVDF膜浸泡于一抗稀释液内，4 ℃孵育过夜。第2天孵育二抗，PBST充分洗涤PVDF膜3次，每次15 min，用封闭液稀释相应的HRP标记二抗后浸泡PVDF膜于二抗孵育液中，室温摇床孵育2 h；最后显色曝光，每张膜滴加适量的ECL(Thermo，NCI5079)底物，孵育数分钟后X光胶片压片后放入显影液及定影液中显影及定影。

1.4酶联免疫吸附(ELISA)实验按照产品说明书使用IFITM2 ELISA试剂盒(MyBioSource，MBS9326883)，准备所有组织样品、试剂和标准品。分别加入相应50 μl样本至标准孔、样品孔及空白对照孔后加入100 μl HRP，37 ℃，孵育60 min，洗板4次，加入酶标试剂A和B各50 μl，37 ℃，避光孵育15 min后加入终止液50 μl，5 min后利用450 nm波长分光光度仪器检测吸光度值。

2 结果

2.1胃癌组织与癌旁组织中IFITM2mRNA和蛋白的表达情况运用qPCR及Western blotting分别检测IFITM2在103例患者胃癌及癌旁组织内mRNA及蛋白的表达水平，胃癌组织IFITM2 mRNA的表达量明显高于癌旁组织(见图1A)，同时癌旁组织IFITM2蛋白含量明显低于癌组织(见图1B)，差异均有统计学意义(P<0.05)。利用ELISA检测103例胃癌患者胃癌组织与癌旁组织内IFITM2的表达量，癌旁组织及癌组织IFITM2表达量平均值分别为(301.94±83.30)ng/L、(654.42±149.10)ng/L(见图1C)，癌组织内IFITM2表达量明显高于癌旁组织，差异有统计学意义(P<0.05)。

注：N:胃癌组织;T:癌旁组织。*P<0.05。

2.2胃癌组织IFITM2表达量与患者性别、年龄、癌肿大小、TNM分期及分化程度的关系ELISA检测结果显示，IFITM2表达量与患者性别、年龄无显著相关性(P>0.05)。但与癌肿大小、TNM分期呈显著正相关，与分化程度呈显著负相关(P<0.01)。胃癌肿块越大，TNM分期越高，IFITM2表达量越高；但胃癌的分化程度越高，其表达量越低，差异均有统计学意义(P<0.01)(见表1)。

表1 IFITM2表达量与患者性别、年龄、癌肿大小、TNM分期及分化程度的关系Tab 1 The relationship of IFITM2 expression with sex, age,size of tumor, TNM stage and degree of differentiation

2.3IFITM2表达量与患者生存时间之间的关系利用Kaplan-Meier法分析103例患者5年随访结果得出：IFITM2低表达患者5年生存率为42.9%，生存时间为(52.34±2.16)个月，IFITM2中表达患者5年生存率32.4%，生存时间为(44.82±2.89)个月，IFITM2高表达患者5年生存率17.6%，生存时间为(30.59±3.47)个月。IFITM2与患者的术后5年生存率呈显著负相关(P<0.05)(见图2)。

3 讨论

胃癌是起源于胃黏膜上皮的恶性肿瘤，每年全世界大约有99万患者被诊断为胃癌，其中约73万因此而死亡，从而使其成为第四常见的肿瘤及第二因其而死亡的恶性肿瘤[11]。胃癌发病率在不同的国家有所不同，但我国的发病率却相对较高，男女发病率约为2∶1。

图2 IFITM2表达量与患者生存时间之间的关系 Fig 2 Relationship between IFITM2 expression and survival time of patients

胃癌是一个多因素引起的疾病，其中环境和遗传因素都起着重要的作用[12-13]。早期胃癌多数患者无明显症状，少数人有呕吐、恶心或类似溃疡病的上消化道症状，难以引起足够的重视[14]。随着肿瘤的生长，影响胃功能时才出现较为明显的症状，但均缺乏特异性，再加上目前有限的治疗手段和较差的临床预后使得寻找一个可预见生存时间的预后因子及治疗手段迫切重要[15-16]。IFITM在肿瘤中的作用近年来越来越受到关注，因此，本研究以IFITM2基因为切入点，深入探究其与胃癌发生及预后的关系。

IFITM是很早被证实的干扰素诱导蛋白家族成员之一，又称为1～8干扰素诱导基因家族，包括IFITM1、IFITM2和IFITM3。它们的5′端均含有干扰素刺激反应元件(ISRE)，均能被IFN-α、IFN-β和IFN-γ干扰素刺激诱导，并通过JAK-STAT信号传导途径，作用于ISRE后诱导IFITM蛋白的分泌[17-18]。IFITM蛋白家族不仅可以抑制多种病毒的复制，例如虫媒病毒、冠状病毒、丝状病毒、崩芽病毒、甲型流行性感冒病毒和人类免疫缺陷病毒[19]；而且它们在不同的细胞生长发育过程中也起着很多重要的作用，包括免疫细胞调控、细胞黏附作用、骨矿化生殖细胞归巢和成熟过程[20-21]。近来更有研究显示，IFITM蛋白在肿瘤发展及迁移过程中起着重要的作用。IFITM1在食管癌、宫颈癌和卵巢癌中均高表达，IFITM1甚至可以通过促进胃癌的转移和侵袭而加速其恶化[22]。IFITM3在胃癌组织内表达量也明显升高，其表达沉默，能有效地降低胃癌细胞株的增殖、转移及侵袭能力[23]。在裸鼠实验中观测到，IFITM2在正常的星状细胞中的表达明显低于星状细胞瘤[24]。同时，IFITM2与促凋亡P53基因相互作用在调节肿瘤细胞的坏死通路中发挥着十分重要的作用[25]。XU等[26]研究中发现，胰岛素生长因子通过胰岛素生长因子1 受体及其信号传导及转录因子3通路可以部分激活IFITM2表达；同时，激活的IFITM2又可以调节白细胞介素6的表达及分泌。而沉默IFITM2表达可以有效地抑制肿瘤细胞的增殖及转移。本研究结果也显示，在胃癌患者的癌组织内IFITM2 mRNA和蛋白的表达量明显高于癌旁组织。同时，胃癌肿块越大，TNM分期越高，胃癌的分化程度越低，IFITM2表达量越高，差异均有统计学意义。而IFITM2高表达的胃癌患者其5年生存率却明显降低。

综上所述，胃癌组织内IFITM2的高表达可以进一步促进肿瘤的恶化，并导致胃癌患者术后5年生存率明显下降。因此，其可以作为一个潜在的胃癌治疗靶点以及对患者术后生存时间的预测因子。