吲哚美辛联合奥沙利铂对大肠癌细胞生物学行为的影响及机制研究

吴维宇， 覃 岭，张 军，高 龙

成都医学院第一附属医院消化内科，四川 成都 610500

大肠癌是常见的消化道恶性肿瘤之一，包括结肠癌和直肠癌。大肠癌的发病与遗传、饮食、生活习惯及大肠相关疾病等有关，随着人们饮食习惯及生活环境的改变，其发病率正逐年上升[1]。目前针对大肠癌的治疗方法主要有手术、药物治疗、放疗及化疗，而化疗是治疗大肠癌最常用的方法之一。吲哚美辛(Indomethacin)又称消炎痛，是一种非皮质激素类作用较强的消炎和镇痛药[2-3]。吲哚美辛可通过抑制环氧酶的活性阻碍前列腺素的合成，抑制炎性反应，此外，吲哚美辛还可抑制溶酶体酶的释放及白细胞的趋化性等，达到解热、镇痛及消炎的作用[4]。近年来研究发现，吲哚美辛具有抗肿瘤的作用，可调整机体免疫反应，同时还可起到化疗增敏的作用[5-6]。奥沙利铂(Oxaliplatin)是一种二氨环己烷的铂类化合物，属于第3代铂类抗癌药，其靶作用部位是DNA，可抑制DNA的复制和转录，抑制肿瘤细胞增殖，诱导细胞凋亡[7]。奥沙利铂是目前治疗大肠癌常用的化疗药物之一，对5-氟尿嘧啶(5-FU)及其他铂类化疗药物治疗无效的大肠癌患者仍有效[8]。奥沙利铂对机体神经毒性较大，因此在临床上使用时应尽量减少其用量[9]。因此，本实验以吲哚美辛与奥沙利铂对人大肠癌细胞生物学特性的影响及联合应用起到化疗增敏作用可行性进行研究，并对其作用机制进行初步探讨。

1 材料与方法

1.1材料人大肠癌细胞株SW620(中国科学院上海生命科学院细胞库)；吲哚美辛标准品(美国Sigma公司)；奥沙利铂标准品(江苏恒瑞医药股份有限公司)；胎牛血清、RPMI 1640培养基(美国Hyclone公司)；噻唑蓝(Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide，MTT)(美国Sigma公司)；Transwell小室(美国Corning公司)；Matrigel基质胶(美国BD公司)；Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒(江苏凯基生物技术股份有限公司)；二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白浓度检测试剂盒(碧云天生物技术有限公司)；ECL底物化学发光试剂盒(上海炎熙生物科技有限公司)；基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2，MMP-2)抗体、基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)抗体、剪切的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3(Cleaved Caspase-3)抗体及辣根过氧化物酶标记的二抗(美国Abcam公司)。

1.2人大肠癌细胞培养和处理人大肠癌细胞SW620培养于含质量浓度为100 g/L胎牛血清的RPMI 1640培养基，置于体积分数为5%的CO2饱和湿度的37 ℃恒温培养箱中培养。取对数生长期的大肠癌细胞，用质量浓度为2.5 g/L胰蛋白酶消化，1 500 r/min离心5 min，以培养液重悬细胞，调整细胞浓度为2×104ml-1，接种于24孔细胞培养板中，继续培养24 h。将细胞分为4组，终浓度设定依据预实验中吲哚美辛和奥沙利铂对大肠癌细胞72 h的IC50浓度设置。吲哚美辛组加入终浓度为200 ng/ml的吲哚美辛，奥沙利铂组加入终浓度为25 μg/ml的奥沙利铂，吲哚美辛联合奥沙利铂组同时加入200 ng/ml的吲哚美辛和25 μg/ml的奥沙利铂，对照组不加药物处理，每组细胞均设置3个复孔，置于常规细胞培养箱中继续培养。

1.3MTT法检测各组大肠癌细胞增殖抑制情况取各组处理后24 h的细胞，采用MTT法测定各组大肠癌细胞增殖抑制情况。每孔加入MTT溶液20 μl，置于37 ℃培养箱中培养4 h，弃旧培养液，分别加入二甲基亚砜溶液150 μl，混匀后于震荡仪上振荡反应10 min，在酶标仪上492 nm处测定吸光度值(A值)。计算各组细胞增殖抑制率，抑制率(%)=1-(实验组A值/对照组A值)×100%。

1.4流式细胞术检测各组大肠癌细胞凋亡情况对照组、吲哚美辛组、奥沙利铂组、吲哚美辛联合奥沙利铂组处理后培养24 h，分别收集各组细胞，用PBS洗涤细胞2次后，加入约400 μl PBS溶液重悬细胞，加入Annexin V-FITC 5 μl轻轻混匀，再加入PI染液5 μl，置于室温中避光孵育15 min，将细胞混合液加入流式上样管中，用流式细胞仪检测各组细胞情况，并统计各组大肠癌细胞的凋亡率。

1.5Transwell实验检测各组大肠癌细胞迁移和侵袭能力在Transwell小室的上室和下室分别加入200 μl和600 μl无血清培养基，置培养箱中孵育2 h，将待检测的各组大肠癌细胞用无血清培养基重悬细胞制成单细胞悬液，取出平衡后的Transwell小室， Transwell下室加入含质量浓度为100 g/L胎牛血清的培养基600 μl，Transwell上室加入细胞悬液200 μl，于培养箱中培养48 h后取出Transwell小室，用棉签擦去上室细胞及碎片，用2 ml多聚甲醛固定10 min后加入500 μl结晶紫溶液进行染色，在倒置显微镜下观察拍照，计数穿膜细胞个数，统计细胞迁移能力。以同样的方法检测各组大肠癌细胞侵袭能力，Transwell上室滤膜经Matrigel基质胶涂覆，其余步骤同Transwell迁移实验。以对照组为参照，计算相对迁移和侵袭指数表示细胞迁移和侵袭能力。

1.6Westernblotting检测各组大肠癌细胞中CleavedCaspase-3、MMP-2、MMP-9蛋白表达水平对照组、吲哚美辛组、奥沙利铂组、吲哚美辛联合奥沙利铂组处理后培养24 h，收集各组细胞加入细胞裂解液，提取总蛋白，以BCA试剂盒测定蛋白浓度，在聚丙烯酰胺凝胶电泳每个泳道孔中加入40 μg变性蛋白，电泳分离蛋白，转膜，用TBS漂洗，置于质量浓度为50 g/L的脱脂奶粉中封闭2 h。分别加入含Cleaved Caspase-3一抗(1∶800稀释)、MMP-2一抗(1∶500稀释)、MMP-9一抗(1∶500稀释)进行杂交，4 ℃下过夜反应，再用二抗(1∶3 000稀释)进行杂交，室温反应2 h。以ECL化学发光，成像仪曝光后采用Image J图像分析系统分析各条带灰度值，以β-actin为内参，分析各组大肠癌细胞中Cleaved Caspase-3、MMP-2、MMP-9蛋白的表达量。

2 结果

2.1药物处理后对大肠癌细胞增殖的影响处理后24 h以MTT法检测各组大肠癌细胞增殖情况，对照组、吲哚美辛组、奥沙利铂组、吲哚美辛联合奥沙利铂组细胞增殖抑制率分别为0、(29.96±3.11)%、(32.14±3.45)%、(75.29±8.07)%，与对照组相比，吲哚美辛组和奥沙利铂组单用药组的细胞增殖抑制率明显上升，差异有统计学意义(P<0.05)；与单用药组相比，吲哚美辛联合奥沙利铂组细胞增殖抑制率显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)。提示吲哚美辛和奥沙利铂可抑制大肠癌细胞增殖，且吲哚美辛联合奥沙利铂具有协同抑制大肠癌细胞增殖的作用。

2.2药物处理后对大肠癌细胞凋亡的影响处理后24 h以流式细胞仪检测各组大肠癌细胞凋亡情况，结果如图1所示，对照组、吲哚美辛组、奥沙利铂组、吲哚美辛联合奥沙利铂组细胞增殖抑制率分别为(3.46±0.42)%、(21.87±2.43)%、(22.47±2.55)%、(58.14±6.28)%，与对照组相比，吲哚美辛组和奥沙利铂组的细胞凋亡率明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)；与单用药组相比，吲哚美辛联合奥沙利铂组细胞凋亡率显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)。提示吲哚美辛和奥沙利铂可诱导大肠癌细胞凋亡，且吲哚美辛联合奥沙利铂具有协同诱导大肠癌细胞凋亡的作用。

图1 流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况Fig 1 Apoptosis detected by flow cytometry

2.3药物处理后对大肠癌细胞迁移和侵袭的影响处理后24 h以Transwell实验检测各组大肠癌细胞迁移和侵袭能力，结果如表1和图2～3显示，与对照组相比，吲哚美辛组和奥沙利铂组的细胞迁移和侵袭能力均明显减弱，差异有统计学意义(P<0.05)；与吲哚美辛组及奥沙利铂组相比，吲哚美辛联合奥沙利铂组细胞迁移、侵袭能力显著减弱，差异有统计学意义(P<0.05)。提示吲哚美辛和奥沙利铂可抑制大肠癌细胞迁移和侵袭能力，且吲哚美辛联合奥沙利铂具有协同抑制大肠癌细胞的迁移和侵袭能力。

图2 细胞培养图片 A：100×；B: 200×； 图3 Transwell检测细胞侵袭和迁移能力(200×) A：Transwell检测各组细胞迁移能力；B：Transwell检测各组细胞侵袭能力Fig 2 Cell culture pictures A: 100×; B: 200×; Fig 3 Transwell was used to detect cell invasion and migration ability (200×)A: cell migration ability in each group detected by Transwell; B: invasive ability of cells in each group detected by Transwell

2.4药物处理后对大肠癌细胞CleavedCaspase-3、MMP-2、MMP-9蛋白表达水平的影响Western blotting检测各组大肠癌细胞中Cleaved Caspase-3、MMP-2、MMP-9表达的影响，结果如图4和表2所示，与对照组相比，吲哚美辛组和奥沙利铂组的细胞中Cleaved Caspase-3表达明显升高，MMP-2、MMP-9表达明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)；与单用药组比， 吲哚美辛联合奥沙利铂组细胞中Cleaved Caspase-3表达显著升高，MMP-2、MMP-9表达显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)。提示吲哚美辛和奥沙利铂可上调Cleaved Caspase-3的表达，下调MMP-2、MMP-9表达， 吲哚美辛联合奥沙利铂可协同上调Cleaved Caspase-3的表达，下调MMP-2、MMP-9表达。

表1 药物对大肠癌细胞迁移和侵袭能力的影响Tab 1 Effects of drugs on migration and invasion of colorectal

注：与对照组比较，*P<0.05；与吲哚美辛组比较，&P<0.05；与奥沙利铂组比较，#P<0.05。

图4 Western blotting检测细胞中Cleaved Caspase-3、MMP-2、MMP-9蛋白表达水平 Fig 4 The expressions of Cleaved Caspase-3, MMP-2 and MMP-9 proteins in the cells detected by Western blotting

表2 药物对大肠癌细胞中Cleaved Caspase-3、MMP-2、MMP-9表达的影响Tab 2 Effects of drugs on expressions of Cleaved Caspase-3, MMP-2 and MMP-9 in colorectal cancer

注：与对照组比较，*P<0.05；与吲哚美辛组比较，&P<0.05；与奥沙利铂组比较，#P<0.05。

3 讨论

随着人们生活习惯的改变，饮食、睡眠、锻炼及工作压力等方面的影响，大肠癌的发病率正逐年上升，严重威胁着人类的健康和生命安全[10]。化疗作为治疗大肠癌的主要方法之一，化疗药物的选择和使用是治疗大肠癌的重要因素[11]。研究显示，吲哚美辛可抑制大肠癌细胞株HCT116的增殖和侵袭[12]，此外，也有研究报道，吲哚美辛作用于宫颈癌、胆囊癌、乳腺癌、肺癌等细胞，具有较好的抗癌疗效[13-15]。近期研究显示，吲哚美辛具有化疗增敏效果。奥沙利铂是大肠癌术后辅助化疗常用的化疗药物，具有较强的抗癌效果。但其神经毒性较大，通过某些化疗增敏药物联合奥沙利铂治疗肿瘤，可减少其毒副作用，又可增加其抗肿瘤效果[16]。因此本研究考虑将吲哚美辛与奥沙利铂联合作用于人大肠癌细胞，提高对大肠癌的抗肿瘤效果。实验结果显示，吲哚美辛和奥沙利铂对人大肠癌细胞具有抑制细胞增殖、迁移和侵袭的能力，诱导细胞凋亡，吲哚美辛联合奥沙利铂具有协同抑制大肠癌细胞增殖、迁移和侵袭的能力，协同诱导细胞凋亡。提示吲哚美辛对奥沙利铂的抗大肠癌起到增敏的效果，二者联合使用具有协同抗癌的作用。

Caspase-3是蛋白水解酶家族成员之一，属于凋亡执行者[17]。Cleaved Caspase-3是Caspase-3活化形式，参与细胞凋亡的过程，诱导细胞发生凋亡[18]。本实验结果显示，吲哚美辛与奥沙利铂组细胞中Cleaved Caspase-3的表达明显高于对照组，联合使用Cleaved Caspase-3的表达显著高于单用药组，提示吲哚美辛组、奥沙利铂及二者联合使用可通过诱导Caspase-3的活性，诱导大肠癌细胞凋亡。研究显示，基质金属蛋白酶(matrix metalloproteases, MMPs)是一种蛋白水解酶家族，可促进细胞迁移、降解细胞外基质和裂解细胞因子等多种生理功能，与细胞转移和侵袭关系密切[19]。在多种肿瘤细胞中，MMP-2、MMP-9表达水平的高低可作为细胞转移、侵袭能力高低的指标[20-21]。本实验结果表明，吲哚美辛、奥沙利铂及二者联合使用可通过抑制MMP-2、MMP-9的表达水平，抑制大肠癌细胞转移和侵袭的能力。此外已有研究证实，吲哚美辛可激活食管癌EC109细胞Caspase-3活性，诱导细胞凋亡[22]；人肺癌裸鼠移植瘤实验中，吲哚美辛联合奥沙利铂可显著抑制移植瘤中MMP-2的表达[23]。

本实验结果显示，吲哚美辛联合奥沙利铂应用具有协同抗大肠癌的作用，其作用机制是通过上调Caspase-3的活性抑制大肠癌细胞增殖诱导细胞凋亡，通过下调MMP-2、MMP-9的表达抑制细胞转移和侵袭的能力，为大肠癌的治疗提供新的思路。