下调KDM1A基因对结直肠癌细胞增殖、侵袭及AKT信号通路的影响

潘春鹏， 李 峰

上海交通大学医学院附属第九人民医院普外科，上海 200433

赖氨酸特异性组蛋白去甲基化酶1(lysine specific demethylase 1, LSD1/KDM1A)作为胺氧化酶家族成员，是最早被发现的组蛋白去甲基化酶，可通过除去底物或组蛋白结构以外的甲基调控基因表达，参与细胞的增殖、侵袭和凋亡等生物学过程，因其在非小细胞肺癌、前列腺癌和舌癌等多种肿瘤组织或细胞中异常高表达，具有促进肿瘤发生、发展的作用而备受学者们的关注[1-3]。已有研究[4-5]证实，KDM1A在结直肠癌中异常高表达，发挥着促进肿瘤细胞生长的作用，但其具体的作用机制尚不明确。近年来研究[6-7]发现，KDM1A可负向调控AKT信号通路抑制肿瘤的发生、发展，但其有无通过介导AKT信号通路参与结直肠癌细胞的增殖和侵袭过程尚未可知。因此，本研究通过体外干扰结直肠癌HCT15细胞中KDM1A表达，探讨其对细胞增殖、侵袭和AKT信号通路的影响，以期从KDM1A负向调控AKT角度揭示其对结直肠癌的抑制作用。

1 材料与方法

1.1主要试剂和仪器LipofectamineTM2000转染试剂、Trizol试剂、KDM1A小干扰RNA(si-KDM1A)和阴性对照(si-NC)购自美国Invitrogen公司。Opti-MEM培养基、胎牛血清、青链霉素和RPMI-1640培养基购自美国Gibco公司，MTT试剂购自美国Simga公司，逆转录试剂盒、BCA蛋白定量试剂盒和蛋白提取试剂盒购自碧云天生物公司，化学发光试剂盒购自美国Bioworld公司，PI周期试剂盒购自联科生物公司，RT-PCR试剂盒购自日本Takara公司，GAPDH抗体、p21抗体、Cyclin D1抗体、MMP-2抗体和HRP标记的羊抗兔二抗购自美国Santa Cruz公司，KDM1A抗体购自美国R&D公司。Transwell小室购自美国Millipore公司，CO2恒温细胞培养箱购自美国Thermo公司， 倒置显微镜购自重庆光学仪器厂，酶标仪购自天津开元生物公司，流式细胞仪购自美国BD公司。凝胶成像分析系统和转膜仪购自美国BIO-RAD公司。

1.2细胞培养及处理人结直肠癌HCT15细胞购自中国科学院细胞库。以含有质量浓度为100 g/L胎牛血清、100 μg/ml链霉素和100 U/ml青霉素的RPMI-1640细胞培养基及体积分数为5%的CO2、饱和湿度、37 ℃培养条件的孵箱培养，定期观察细胞生长情况，每2 d更换1次培养液。当细胞汇合度约为85%时，加入胰蛋白酶消化传代。收集长势良好的对数生长期细胞，以每孔5×105个细胞接种至6孔细胞板上，常规条件下培养过夜。次日，根据LipofectamineTM2000转染试剂说明书步骤将20 μmol/L si-KDM1A转染至HCT15细胞，作为si-KDM1A组，而转染si-NC的细胞作为si-NC组。转染结束后，于孵箱中常规培养，待培养48 h后收集细胞用以RT-PCR和Western blotting检测。

1.3RT-PCR检测采用Trizol法提取si-NC组和si-KDM1A组细胞的总RNA。依照反转录试剂盒合成cDNA后，将产物上PCR仪进行扩增。扩增条件为95 ℃预变性30 s，1个循环; 95 ℃变性5 s，40个循环；58 ℃退火30 s，40个循环。根据大连宝生物公司合成的引物序列：KDM1A：上游序列5′-GGCAGCAGCTCGACAGTTACAA-3′，下游序列5′-TACCACCATGGCTGGAAGATCA-3′；内参GAPDH：上游序列5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′，下游序列5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3′，以 2-ΔΔCt法计算si-NC组和si-KDM1A组细胞中KDM1A mRNA的相对表达量。

1.4MTT检测收集转染后的si-NC组和si-KDM1A组细胞，以每孔3×105个接种至96孔细胞板上，每组设6个平行孔。于孵箱中常规培养24～72 h，培养至所需时间后，加入 MTT溶液(质量浓度为5 g/L，体积20 μl)作用4 h。吸去孔内培养液后，加入二甲基亚枫(体积150 μl)反应10 min。以酶标仪检测各组细胞在490 nm处的光密度值(OD值)。

1.5FCM检测收集转染48 h后的si-NC组和si-KDM1A组细胞，经胰蛋白酶消化后，以1 500 r/min离心10 min。磷酸缓冲液洗涤后，加入预冷的质量浓度为700 g/L的乙醇4 ℃下固定24 h。洗涤后，加入500 μl碘化丙啶37 ℃下避光染色15 min。上流式细胞仪检测各组细胞的周期变化。

1.6Transwell小室检测首先在Transwell小室铺上基质胶，常温下融合2 h。其次，将转染48 h后的si-NC组和si-KDM1A组细胞加胰蛋白酶消化后，离心弃上清，加入无血清的培养基制备浓度为1×105ml-1的细胞悬液。取Transwell小室，于上室中每孔接种100 μl制备的细胞悬液，于下室中加入含血清的培养基，放入孵箱中培养。24 h后取出底膜，小心拭去上室中未穿过的细胞，冰甲醇固定10 min下室中的细胞，并以结晶紫染色20 min。随机选取6个视野，于倒置显微镜下观察计数。

1.7Westernblotting检测采用总蛋白提取试剂盒获取si-NC组和si-KDM1A组细胞的总蛋白，经BCA法对所提总蛋白定量后，取变性蛋白50 μg行SDS-PAGE电泳，以80 V电压电泳至溴酚蓝跑至分离胶后，更换200 V电压电泳，待溴酚蓝到达分离胶底部时结束电泳。采用转膜仪以250 mA电流将蛋白样品转至PVDF膜上。再经去脱脂奶粉的TBST封闭液室温封闭1 h后，加入1∶1 000倍稀释的KDM1A抗体，4 ℃反应过夜。次日，加入1∶3 000倍稀释的HRP标记的羊抗兔二抗，室温反应1 h。封闭液洗膜后，在暗室内加入ECL试剂曝光拍照，采用Iamge J软件以目的蛋白与内参GAPDH蛋白的灰度值比表示目的蛋白的相对表达量。

2 结果

2.1si-KDM1A对结直肠癌HCT15细胞中KDM1AmRNA和蛋白表达的影响将si-KDM1A转染至HCT15细胞48 h后，RT-PCR和Western blotting检测其干扰效果，结果如图1所示。KDM1A mRNA和蛋白在si-KDM1A组中的相对表达量分别为0.24±0.01和0.31±0.02，与si-NC组1.00±0.06和0.86±0.05相比均明显降低(t1=5.422，P=0.006；t2=3.105，P=0.036)。si-KDM1A成功下调结直肠癌HCT15细胞中KDM1A的表达。

2.2下调KDM1A表达对结直肠癌HCT15细胞增殖和细胞周期的影响MTT法检测si-NC组和si-KDM1A组细胞的增殖能力，结果见图2A。24、48和72 h作用时间下，si-KDM1A组细胞的OD值分别为0.52±0.02、0.60±0.04和0.67±0.05，而si-NC组细胞的OD值分别为0.65±0.05、0.78±0.06和0.89±0.06，si-KDM1A组细胞的增殖能力较si-NC组明显降低(t1=4.181，P=0.014；t2=4.326，P=0.012；t3=4.879，P=0.008)。流式细胞仪检测两组细胞转染48 h后的周期分布情况，结果见图2B。与si-NC组G1期(58.68±6.05)%、S期(24.52±1.63)%和G2期(16.76±1.55)%相比，si-KDM1A组细胞在G1期所占百分比(76.35±5.29)%升高(t=3.808，P=0.019)，而S期(17.86±1.16)%和G2期(5.78±0.33)%均明显降低(t1=5.766，P=0.005；t2=12.001，P=0.000)。猜测，下调KDM1A表达可能通过诱导细胞阻滞于G1期抑制HCT15细胞增殖。

注：与si-NC组相比，*P<0.05。

图1si-KDM1A对HCT15细胞中KDM1A的干扰效果

A：Western blotting检测结果；B：RT-PCR检测结果

Fig1Theinterferenceeffectofsi-KDM1AonKDM1AinHCT15cellsA: the result of Western blotting detection; B: the result of RT-PCR test

注：与si-NC组相比，*P<0.05。图2 KDM1A基因对结直肠癌HCT15细胞增殖和细胞周期的影响 A：各组细胞的OD值；B：各组细胞的周期分布Fig 2 The effect of KDM1A gene on the proliferation and cell cycle of colorectal cancer HCT15 cells A: the OD value of cells in each group; B: the cell cycle distribution

2.3下调KDM1A表达对结直肠癌HCT15细胞侵袭能力的影响转染48 h后，采用Transwell小室检测HCT15细胞的侵袭能力，结果见图3。si-KDM1A组细胞的侵袭细胞数从si-NC组的(126.55±10.30)个降为(81.75±6.85)个，差异有统计学意义(t=5.853，P=0.004)。可见，下调KDM1A表达可明显抑制HCT15细胞的侵袭能力。

注：与si-NC组相比，*P<0.05。图3 KDM1A基因对结直肠癌HCT15细胞侵袭能力的影响Fig 3 The influence of KDM1A gene on the invasive ability of colorectal cancer HCT15 cells

2.4下调KDM1A表达对AKT信号通路相关蛋白p21、CyclinD1、MMP-2和p-AKT表达的影响采用Western blotting进一步检测HCT15细胞中AKT信号通路相关蛋白p21、 Cyclin D1、MMP-2和p-AKT的表达情况，结果见图4。转染si-KDM1A后，p21蛋白的相对表达量从si-NC组的0.31±0.02升高为0.63±0.04，而Cyclin D1、MMP-2和p-AKT蛋白的相对表达量分别从1.18±0.07、0.76±0.05、0.52±0.03下降为0.48±0.03、0.37±0.03、0.22±0.01，经独立样本t检验分析，差异均有统计学意义(t1=12.394，P=0.000；t2=15.920，P=0.000；t3=11.585，P=0.000；t4=16.432，P=0.000)。结果表明，KDM1A基因可通过抑制AKT信号通路参与结直肠癌HCT15细胞的增殖和侵袭。

3 讨论

结直肠癌是一种常见的消化系统恶性肿瘤，其排名居全世界恶性肿瘤的第3位。据统计[8-9]，世界上每年因结直肠癌死亡的人数达60万，每年新增的发病人数高达120万，且其发病率仍呈上升趋势。癌症的发生和转移是一个受多种基因和信号通路共同调控的复杂过程，其治疗一直是一个世界性难题。探讨结直肠癌的发生、发展机制对结直肠癌的治疗和预后具有重要意义。KDM1A是一个位于人类1号染色体的保守基因，因其特殊的去甲基化功能和多种染色质调节功能，可调控多种基因的表达，进而参与肿瘤的发生、发展过程。如KDM1A可通过下调KLF2基因的表达抑制胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力，通过调控E2F基因参与口腔癌细胞的增殖[10-11]；同时还通过抑制PI3K/Akt信号活性抑制雌激素驱动的子宫内膜癌细胞增殖，并诱导G1细胞阻滞和细胞凋亡[6]。已有研究[5]证实,沉默KDM1A表达可抑制结直肠癌SW620细胞的增殖和侵袭，但其具体的调控机制还不明确。本研究通过体外细胞实验在结直肠癌HCT15细胞中成功下调KDM1A表达后，发现其除了能够显著抑制HCT15细胞增殖和侵袭外，还能够将细胞阻滞于G1期；此外，AKT信号通路也明显受到抑制。提示，KDM1A可能通过抑制AKT信号通路发挥抗结直肠癌细胞增殖和侵袭的作用。

图4 各组细胞中AKT信号通路相关蛋白的表达 A：Western blotting检测结果；B：AKT信号通路相关蛋白的相对表达量Fig 4 The expression of AKT signaling pathway related proteins in each group of cells A: the result of Western blotting detection;B: the relative expression of AKT signaling pathway related proteins

AKT是PI3K/AKT信号传导通路中的中枢效应蛋白，活化的AKT可调控多种基因的表达，参与细胞的增殖、侵袭和凋亡等过程，与结直肠癌的发生、发展关系密切[12]。p21是一种重要的细胞周期素依赖性激酶抑制因子，在细胞G1/S期转换过程中发挥着负向调控的作用，同时也是一种重要的抑癌基因，参与结直肠癌的发展进程[13]；Cyclin D1是细胞周期G1/S的特异性周期蛋白，在细胞从G1期进入S期时发挥着重要的推动作用，同时也是一种原癌基因，其过度表达可导致结胞的增殖失控，而恶化形成结直肠癌等肿瘤[14]；MMP-2是一种能够降解细胞外基质的基质金属蛋白酶，在细胞的增殖、分化、侵袭、迁移和血管生成等方面发挥着重要的调控作用，与结直肠癌的发生、发展密切相关[15]。研究[16-17]证实，AKT信号通路可调控p21、Cyclin D1和MMP-2的表达，参与细胞的增殖和侵袭过程。为了进一步探讨下调KDM1A表达抑制结直肠癌的增殖侵袭的分子机制，本研究采用Western blotting进一步检测HCT15细胞中AKT信号通路相关蛋白p21、Cyclin D1和MMP-2的表达。结果发现，在成功转染KDM1A干扰序列的HCT15细胞中p21蛋白表达明显升高，而Cyclin D1和MMP-2蛋白表达明显降低。提示，KDM1A可能通过调控AKT信号通路介导p21、Cyclin D1和MMP-2表达参与结直肠癌的发生、发展过程。

总之，下调KDM1A基因可抑制结直肠癌HCT15细胞的增殖和侵袭，其分子机制可能与抑制AKT信号通路的活化有关。当然，KDM1A除了对AKT信号通路有一定的调控作用外，还对Wnt 和Notch等信号通路有影响[18-19]，结直肠癌的发生、发展是一个复杂的过程，KDM1A在结直肠癌中的促癌作用还有待学者们更深入的研究。