黄芪多糖提取工艺优化及其抗氧化活性研究

胡碧君

（广州中医药大学第一附属医院，广东 广州 510400）

黄芪为豆科草本植物蒙古黄芪 Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.var.mongholicus（Bge.）Hsiao 或 膜荚黄芪 Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.的干燥根，性温，味甘，有补气升阳、利水消肿、补气固表功效[1－2]。黄芪多糖是黄芪的主要活性成分之一，具有抗肿瘤、抗衰老、抗病毒、增强免疫力、促进免疫器官功能和抗体的生成、改善心血管功能、双向调节血糖等作用[2－4]。目前黄芪多糖的提取方法为蒸馏水提取法，简单易行，但提取率较低，且纯度不高，使得提取成本过高，限制了其研究与开发。本试验中应用微波辅助提取法提取黄芪多糖，利用响应面法优化其提取工艺，并研究了其体外抗氧化活性，以期找出更合理经济的提取工艺，为黄芪的开发利用提供理论基础。

1 仪器与试药

1.1 仪器

DSY－9002型戴生高速万能粉碎机（永康市九顺莹商贸有限公司）；GHZ型微波萃取器（北京国环高科有限公司）；UV－8000A型紫外分光光度计（天津天光光学仪器有限公司）。

1.2 试药

黄芪（Astragalus membranaceus）药材饮片购于广州济和堂中药店，经广东药科大学天然药物化学教研室王定勇教授鉴定为黄芪；葡萄糖标准品（上海源叶生物科技有限公司，批号为 Z110833）；浓硫酸、苯酚等其他试剂（分析纯）。

2 方法与结果

2.1 提取工艺流程

黄芪→粉碎→过筛→石油醚回流脱脂脱色2次（每次1 h）→烘干→微波辅助水提取→抽滤→滤液减压浓缩→5倍体积 95% 乙醇沉淀12 h→5 000 r／min离心15 min→沉淀物→无水乙醇洗涤→水溶→Sevage法脱蛋白5次→冷冻干燥→多糖粗品[5－6]。

2.2 多糖含量测定（标准曲线绘制）

取葡萄糖标准品50 mg，加水溶解定容，置100 mL容量瓶中，作为母液备用。精密移取 0，0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL 母液，定容于 50 mL 容量瓶中。分别取2 mL置试管中，分别加入6%苯酚1.0 mL和浓硫酸5.0 mL，混匀，静置10 min，冷却至室温，于490 nm波长处测定吸光度。以多糖质量浓度（X，g／L）为横坐标、吸光度（Y）为纵坐标绘制标准曲线[7－8]，得回归方程 Y＝15.676 X＋0.022 8，r＝0.999 7（n＝7），质量浓度线性范围为 0.005 ～ 0.050 g／L。

2.3 微波提取工艺优化

2.3.1 单因素试验

称取2.0 g黄芪干粉若干份，分别选取液料比（因素 A，mL ／g）、提取时间（因素 B，h）、提取功率（因素 C，W）进行单因素试验，分析对多糖提取率的影响。

液料比：在微波功率200 W、提取时间2 h的条件下提取，结果见图1 A。液料比为10～30 mL／g时，黄芪多糖提取率随提取溶剂体积的增加而增大，液料比为30 mL／g时提取率最高（8.54%）；随着溶剂体积继续增加，多糖提取率降低。原因可能是随提取溶剂体积增大，多糖质量浓度越低，传质推动动力越大，提取速率增加，提取率增大；当溶剂体积继续增加达到一定程度时，提取率缓慢降低，可能是因为有大量的杂质溶出，影响多糖浸出率[9－10]。

图1 不同因素对多糖提取率的影响

提取时间：在微波功率200 W、液料比30 mL／g的条件下提取，结果见图1 B。0.5～2 h内，多糖提取率随提取时间增加而增大，2 h时提取率最大（8.47%）；随时间延长，多糖提取率不再增加。可能是因为延长提取时间可增加微波的反射与吸收，增强微波对黄芪的穿透效果，提高多糖的提取率[11－12]。提取时间达2 h后，提取过程达到动态平衡，多糖的提取率变化不大。

提取功率：在液料比30 mL／g、提取时间1 h的条件下提取，结果见图1 C。100～150 W内，多糖提取率逐渐增加。其原因可能是该功率范围内微波可辐射膨胀破裂的临界内压，微波破壁能力逐渐增强。当功率大于150 W后加快了提取溶剂的挥发，反而不利于黄芪多糖的提取[13]。

2.3.2 响应面法优化试验

因素水平选择：见表1。

表1 响应面试验设计与结果

模型建立及显著性分析：根据单因素试验结果，以Box－Behnken试验设计进行提取，以响应面法分析最佳工艺[14]。通过分析表1数据，得二元回归方程 Y＝9.41＋0.19 A＋0.30 B ＋0.082 C －0.45AB ＋0.06 AC ＋0.046 BC － 1.05 A2－ 0.67 B2－ 0.53 C2。由表 2可知，液料比、提取时间一次项和二次项，提取功率二次项，液料比与提取时间的交互项 P＜0.05，说明对提取率有显著影响。经显著性检测，该模型的相关系数 R2＝0.9784，说明该模型与实际试验拟合较好，自变量与响应值线性关系显著[15]。

表2 方差分析和显著性检验结果

各因素间交互效应分析：等高线形状可反映交互作用强弱。液料比与提取时间的等高线呈扁平状(如图2 A)，表明两因素交互作用明显；液料比与提取功率，以及提取时间与提取功率的等高线近似圆形(如图2 B和图2 C)，表明其交互作用对多糖提取率影响均较小。

提取工艺优化：通过分析试验模型，得出黄芪多糖提取最优工艺参数为，液料比 30.46 mL／g，提取时间

图2 各因素交互作用对黄芪多糖提取的响应面和等高线图

2.2 1 h，提取功率 204.45 W。在此提取条件下，黄芪多糖提取率理论值为9.74%。

2.3.3 验证试验

采用优化提取条件进行工艺验证试验，测得多糖平均提取率为 9.69% ，结果的 RSD ＝1.03% （n＝3），与理论值相比，相对偏差较小，说明该模型可较好地预测各因素与黄芪多糖提取率间的关系。

2.4 抗氧化活性研究

DPPH·清除率测定：取系列质量浓度黄芪多糖溶液 2 mL，置试管中，加入质量浓度为 0.04 g／L的DPPH·溶液，混匀，静置 30 min，以 5 000 r／min的速率离心10 min。测定上清液在517 nm波长处的吸光度。按公式，清除率 ＝1－[（A1－A2）／A0]×100%，计算DPPH·清除率[16]。其中 A0为空白组吸光度，A1为样品组吸光度，A2为2 mL样品溶液＋2 mL无水乙醇的吸光度。结果见图 3 A 和图 3 B。可见，在 0.5～2.0 g／L 质量浓度范围内，黄芪多糖DPPH·清除率随质量浓度的增大而增强，但质量浓度超过 2.0 g／L时再继续增加，DPPH·清除能力变化不大。表明黄芪多糖具有一定的DPPH·清除活性，但比维生素C的DPPH·清除能力弱。

羟自由基清除率测定：依次向试管中加入浓度为6 mmol／L 的 H2O2溶液、9 mmol／L 的 FeSO4溶液、9 mmol／L的水杨酸 －乙醇溶液各1 mL，混匀，向其中加入1 mL质量浓度不同的多糖溶液。最后加6 mmol／L的H2O2启动反应，37℃反应30 min，以蒸馏水为空白组，测定各组在510 nm波长处的吸光度。按公式，清除率＝[1－（Ax－ Ax0）／A0]×100% ，计算羟自由基清除率[17]。其中 A0为空白组吸光度，Ax为加样品组吸光度，Ax0为不加显色剂时H2O2样品溶液的吸光度。结果见图3 C和图3 D。可见，黄芪多糖OH·清除率随着质量浓度在0.5～2.5 g／L范围内的增大而增强，具有较好的线性关系，其半数清除时的质量浓度为1.494 g／L。说明黄芪多糖有一定的OH·清除活性，但与维生素C的OH·清除能力相比要差。

图3 黄芪多糖与维生素C的DPPH·及OH·清除率

3 讨论

微波提取技术是指使用适合的溶剂在微波反应器中从天然药用植物、矿物、动物组织中提取各种化学成分的技术和方法。它是通过微波加热作用使得温度急剧升高，水汽化产生的压力将植物的细胞壁冲破，有利于细胞内多糖的释放；同时借助于微波的电磁场，加速被萃取的植物成分向萃取溶剂界面扩散。微波辅助提取技术与现有其他提取技术相比优势明显，可有效地提取物料中的有用成分，对提取物具有高选择性，并具有提取快、产率高、省时、耗能低、溶剂用量少、生产线组成简单、节省投资、无污染等优点[18]。本研究中以微波辅助提取黄芪多糖，结果表明，此方法合理可行；同时，对其体外抗氧化活性进行了初步研究，可为黄芪多糖的研究与开发提供一定的理论依据。

提取制得的黄芪多糖具有一定的抗氧化活性，但与对照品相比偏弱。这可能与提取的黄芪多糖纯度不高有关。通过微波辅助提取可能会将黄芪中的蛋白质、色素等物质提取出来，使得黄芪多糖的纯度不纯。对于黄芪多糖的纯化以及组分的分离将作为下一步的研究工作。

本试验在单因素试验基础上，将响应面法应用于优化黄芪多糖的提取，分析和验证试验结果表明，多糖提取的最佳工艺条件为液料比 30.46 mL／g，提取时间2.21 h，提取功率 204.45 W；在此条件下，多糖平均提取率为9.69%。提取的黄芪多糖具有一定的DPPH·和OH·自由基清除能力。本试验优化得出的黄芪多糖提取工艺及其抗氧化活性初步研究，可为黄芪的研究与开发提供基础。