板蓝根特征图谱及3种成分含量测定研究
2018-12-25殷世宁张春辉王海英
殷世宁，张春辉 ，王海英
（1.山东省青岛市食品药品检验研究院，山东 青岛 266071； 2.山东省青岛市中心医院，山东 青岛 266061）
板蓝根为十字花科菘蓝属植物菘蓝 Isatis indigotica Fort.的干燥根，性寒，味苦，归心、胃经，具有清热解毒、凉血利咽之功效，用于治疗瘟毒发斑、舌绛紫暗、痄腮、喉痹、大头瘟疫、烂喉丹痧、丹毒、痈肿等[1]，主要分布于我国江苏、浙江、福建、河南等地。板蓝根在我国应用历史悠久，《神农本草经》上品栏中已有“蓝实”记载。现今，板蓝根制剂用量之大，堪称中药之最，已报道的板蓝根化学成分有吲哚类、喹唑酮类、喹啉类、芥子苷类、含硫类、有机酸类、氨基酸类和甾醇类[2]，其现行质量标准收载于2015年版《中国药典（一部）》，但仅对板蓝根的性状、显微特征、水分、灰分、浸出物、（R，S）－告依春含量测定等进行了控制，质控方法较单一。为了更全面地控制板蓝根的质量，本研究中参考了2015年版《中国药典（四部）》[3]及文献[4 － 9]，采用高效液相色谱（HPLC）法建立了板蓝根的特征图谱，并对15个特征峰进行标定，同时对板蓝根中尿苷、腺苷、（R，S）－告依春的含量进行测定。现报道如下。
1 仪器与试药
1.1 仪器
Shimadzu LC－20AT型高效液相色谱仪（日本岛津公司）；BP211D型电子天平（精度 0.01 mg，德国 Sartorius公司）；AUTO Science AS10200BT型超声波清洗器（天津奥特赛恩斯仪器有限公司）。
1.2 试药
尿苷对照品（批号为887－200202，含量为100%），腺苷对照品（批号为110879－200202，含量为100%），（R，S）－告依春对照品（批号为 111753－201505，含量为100%），均购自中国食品药品检定研究院；18批板蓝根（S1～S18）产地信息见表1；甲醇为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。
表1 18批供试品相对保留时间测定结果
2 方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱：AgilentEclipsePlusC18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇 － 0.05% 磷酸溶液，梯度洗脱（0～10 min时0.05%磷酸溶液 98%→80%，10～30 min时0.05%磷酸溶液80%→40%，30～35 min时0.05%磷酸溶液 40%→ 20%，35～40 min时 0.05%磷酸溶液：20%→ 40%，40～45 min时 0.05%磷酸溶液40%→ 98%，45～50 min时 0.05%磷酸溶液 98%）；柱温：30 ℃；流速：1.0 mL ／min；检测波长：254 nm；进样量：10 μL。理论板数按（R，S） －告依春峰计应不低于10 000。
2.2 溶液制备
精密称取尿苷对照品18.57mg、腺苷对照品17.28mg、（R，S）－告依春对照品 20.27 mg，分别置 50 mL 容量瓶中，加水定容至50 mL，制成对照品贮备液。分别精密量取尿苷、腺苷对照品贮备液各1 mL，（R，S）－告依春对照品贮备液5 mL，置25 mL容量瓶中，加水定容至25 mL，制 成 每 1 mL 含 尿 苷 14.856 μg、腺 苷 13.824 μg、（R，S）－告依春 81.080 μg的混合溶液，即得混合对照品溶液。取板蓝根样品粉末（过 4号筛）0.2 g，精密称定，精密加水10 mL，称定质量，超声处理（功率300 W，频率40 kHz）30 min，放冷，称定质量，加水补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。
2.3 特征图谱测定
共有特征峰标定：分别精密吸取混合对照品溶液、供试品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，测定50 min，记录42 min色谱图，并以国家药典委员会2012.130723版中药色谱特征图谱相似度评价系统进行计算，生成板蓝根的特征图谱，从中选定共有特征峰15个。通过比较混合对照品溶液及供试品溶液，并结合DAD光谱，得出供试品溶液图谱中15个共有特征峰，其中3号峰为尿苷，4号峰为腺苷，6号峰为（R，S）－告依春。详见图1。
图1 高效液相色谱图
精密度试验：按2.1项下色谱条件，精密吸取同一供试品溶液（S1）10 μL，连续进样 6次，测定共有特征峰15个，以（R，S）－告依春峰作为参照峰（S峰），计算各特征峰与S峰的相对保留时间。结果的 RSD＜1.5%（n＝6），表明仪器精密度良好。
重复性试验：取同一批样品（S1），按 2.2项下方法制备6份供试品溶液，按2.1项下色谱条件分别进行测定，测定共有特征峰15个，计算各特征峰与S峰的相对保留时间。结果的 RSD＜1.5%（n＝6），表明方法重复性良好。
稳定性试验：取同一供试品溶液（S1），按2.1项下色谱条件，分别于 0，1，8，12，24，36 h 时进样，测定共有特征峰15个，计算各特征峰与S峰的相对保留时间。结果的 RSD＜1.5%（n＝6），表明供试品溶液在 36 h内稳定性良好。
相对保留时间确定：采用上述色谱方法分析6批次板蓝根样品（S6，S7，S9，S10，S15，S16），以（R，S） － 告依春峰作为参照峰（S峰），各共有特征峰相对保留时间平均值分别为 0.304，0.332，0.604，0.683，0.799，1.000，1.120， 1.228，1.335，1.383，1.595，1.897，2.025，2.754，2.884，RSD 分别为 0.3% ，0.4% ，0.3% ，0.3% ，0.3% ，0，0.2% ，0.2% ，0.2% ，0.1% ，0.6% ，0.1% ，0.8% ，0.1% ，0.1% （n ＝ 6），允许范围按 ± 5% 计算，各色谱峰相对保留时间均在规定范围内。
特征图谱测定结果：对18个样品进行特征图谱分析，计算相对保留时间。结果见表1。可见，18个样品的15个特征峰相对保留时间均无明显偏差，符合规定限度。
2.4 指标性成分含量测定
2.4.1 方法学考察
线性关系考察：分别精密吸取混合对照品溶液1，3，5，10，15，20 μL，按 2.1 项下色谱条件测定，以峰面积积分值(Y)为纵坐标、进样量（X，μg）为横坐标绘制标准曲线。尿苷、腺苷、（R，S）－告依春的回归方程分别 为 Y＝2.57×106X－5.00×101（r＝0.999 9）， Y＝3.14 ×106X＋9.26×102（r＝1.000 0）， Y＝2.91×105X＋6.64 × 102（r＝0.999 9），线性 范 围 分别 为 0.014 9 ～0.2971 μg，0.013 8 ～ 0.276 9 μg，0.081 1 ～ 1.621 6 μg，上述各成分进样量在相应线性范围内与峰面积积分值线性关系良好。
精密度试验：按2.1项下色谱条件，精密吸取混合对照品溶液10 μL，连续进样6次。结果尿苷、腺苷、（R，S）－告依春峰面积积分值的 RSD分别为 0.08%，0.05%，0.03%（n ＝ 6），表明仪器精密度良好。
重复性试验：取同一批样品（S1），按2.2项下方法制备6份供试品溶液，再按2.1项下色谱条件进行测定。结果尿苷，腺苷，（R，S）－告依春峰面积积分值的RSD 分别为 0.01% ，0.02% ，0.13% （n ＝ 6），表明方法重复性良好。
稳定性试验：取同一供试品溶液（S1），按2.1项下色谱条件，分别于 0，1，8，12，24，36 h 时进样。结果尿苷、腺苷、（R，S）－告依春的峰面积积分值的 RSD均为0.01%(n＝6)，表明供试品溶液在36 h内基本稳定。
加样回收试验：取已知含量的同一批样品（S1）粉末（过4号筛）0.1 g，精密称定，分别精密加入尿苷、腺苷、（R，S）－告依春对照品溶液 3，2，5 mL[对照品溶液质量浓度尿苷为 14.856 μg ／mL，腺苷为 13.824 μg ／mL，（R，S） － 告依春为 81.080 μg／mL]，按 2.2 项下方法制成供试品溶液，精密吸取 10 μL，按 2.1项下色谱条件进行测定，计算回收率。结果见表2。
2.4.2 样品含量测定
取18批板蓝根样品，按2.2项下方法制备供试品溶液，精密吸取10 μL，按2.1项下色谱条件进行测定。结果见表3。
3 讨论
本研究中参考文献[1，4－6]，比较了加水煎煮、加水回流提取、加水超声提取的方法，发现采用加水超声提取的特征图谱效果最佳，色谱峰数量较多，且峰高优势较明显。试验数据表明，采用加水超声提取的方法对（R，S）－告依春的提取率明显高于加水煎煮的方法，原因可能为加水煎煮导致板蓝根的淀粉糊化，影响了（R，S）－告依春的提取。
表2 加样回收试验结果（n＝6）
表3 样品含量测定结果（%，n＝3）
对板蓝根中各化学成分采用等度洗脱方法难以达到满意的分离效果，故考虑采用梯度洗脱。本研究中参考文献[4－9]，分别考察了甲醇－0.1%甲酸溶液、甲醇－水、乙腈－水、甲醇－0.05%磷酸溶液不同比例的流动相，并对梯度比例进行了研究，最终选择文中的流动相，分离效果最好，样品中各特征峰与其他组分峰基本可达基线分离。
目前，采用多成分含量测定法控制中药的质量已成为一种检测趋势[10－11]。本研究中通过采用所建立的特征图谱色谱评价系统，对18批次样品进行测定，结果18批次样品均检出15个特征峰。板蓝根中化学成分复杂，本研究中对板蓝根中尿苷、腺苷、（R，S）－告依春3种成分同时进行测定，指标成分（R，S）－告依春为0.034～0.347% ，腺 苷 为 0.001～0.079% ，尿 苷 为0.010～0.051%，可为板蓝根的质量控制提供参考。
