无创胚胎植入前非形态学质量评价的研究进展

刘丽英

（沈阳市妇婴医院生殖中心，辽宁 沈阳 110014）

近年来不孕不育的发病率显著升高，越来越多的不孕家庭选择通过辅助生殖技术获得子代，但辅助生殖的成功率呈现出停滞不前的局面。目前为了提高妊娠率，大多生殖中心采取多胚胎移植的方式，使得多胎妊娠率居高不下，同时也提高了减胎术的使用及一些母婴并发症的发生率，而即使应用多胚胎移植的策略，妊娠率也十分有限。因此，提高用于移植的单个胚胎质量成为了关键，一方面可以提高胚胎自身的质量，另一方面可以改变筛选策略。而目前胚胎自身质量并不是限制妊娠率的主要因素，提升空间也十分有限，且多数患者并不缺少可供筛选的胚胎，因此改进筛选策略可能是最有希望突破目前较低临床妊娠率的途径。目前应用最广泛、最基本的胚胎筛选方法是通过静态的胚胎形态学观察对胚胎的质量进行评级［1］。该方法操作简便，评估效率高，但评估指标较单一，受主观经验影响较大，只能反映出某些特定时间点的胚胎状态，使得评估结果与真实质量之间存在一定差异，可能导致同一级别的胚胎有着完全不同的发育潜能［2］。据报道，胚胎染色体非整倍性是移植失败的重要原因，而近年来，随着二代测序等技术的发展，大大提高了胚胎染色体检测的效率，在临床上得到了推广，该技术能够有效检出遗传物质有缺陷的胚胎，为胚胎筛选增加了可靠的依据［3-5］。但该技术需要通过胚胎活检来获取细胞进行检测，该过程对胚胎的影响存在争议，Gleicher等［6］对大量研究总结后甚至认为目前临床使用胚胎植入前遗传学筛查（preimplantation genetic screening，PGS）技术应该被限制在研究阶段。因此，寻求可替代途径以及新的筛选条件成为了近年来的研究热点，主要分为两个方向，一是与胚胎紧密接触的环境，另一方向是改进传统筛选技术。近年来在对胚胎液体环境的研究中取得了大量的研究成果，发现了多种可能与胚胎质量相关的物质，包括DNA、mtDNA、蛋白质、氨基酸等。另外，延时成像技术的应用补充了传统形态学的不足，能够提供胚胎发育过程的动态过程数据，极大地丰富了胚胎筛选的客观依据。而且更多的评价方法有望应用于胚胎植入前的评估，从不同的角度更加准确地预测胚胎的发育潜能，最终提高胚胎移植成功率以及实现单胎移植等需求。

1 囊胚液

囊胚液存在于胚胎囊胚腔中，与胚胎关系密切，受培养环境影响较小。囊胚液可以通过囊胚穿刺的方法吸取获得，虽然该方法需要通过对囊胚的滋养层做微穿孔来吸取囊胚液，但这种操作与玻璃化冷冻的穿刺引流过程相同，不会造成不良影响［7］，因此囊胚液的获取基本上符合无创操作的目的。目前对于囊胚液的研究相对较少，主要原因是取材时间窗较短、有一定操作难度、所得液体量微小等，单个胚胎通常仅能获取出约0．01 ml左右的囊胚液，十分有限［8］。

囊胚液中存在核DNA，并且可以成功地纯化、扩增以及进行遗传学分析［8-11］。Palini等［9］对位于17号染色体上的TBC1D3以及位于Y染色体上的TSPY1这两种多拷贝基因进行初步分析，在90%的囊胚液样本中成功扩增了TBC1D3。在成功扩增TBC1D3的样本中，65%的样本检出了TSPY1，表明这些胚胎携带有Y染色体［9］。该研究说明，囊胚液中存在核基因，且可能用于性别鉴定。但是，由于目前检测敏感性较低，单拷贝基因的检测受到了一定限制［12］。

确认囊胚液中的DNA是否具备胚胎基因组代表性十分重要。Gianaroli等［10］将囊胚液与同胚胎来源的极体、卵裂球或滋养层细胞活检中分离出的核DNA相对比，在成功进行全基因组扩增（77%）的囊胚液样本中，有95%的染色体整倍性与极体或卵裂球活检一致，97%与滋养层细胞一致。随后，同一研究组还进行了更大样本量的验证，结论支持了囊胚液核DNA的胚胎代表性［8］。另有研究得出了不同的结论，该研究对每个胚胎进行卵裂球、囊胚液及滋养层细胞的染色体整倍性分析，结果成功扩增的囊胚液样本（63%）中得出86%的非整倍性，其中62%与滋养层细胞相符［11］。值得注意的是，基于较低的敏感性，非整倍性样本有可能为扩增偏倚所致。另外Tobler等［11］还发现，70%的非整倍性卵裂期胚胎最终转归为整倍性囊胚。该结果可能揭示了胚胎发育的一种机制，即在囊胚形成过程中，非整倍体细胞可能会被选择性排除到胚胎细胞外，进入到囊胚液中。

另有学者对囊胚液DNA的可能来源进行了分析，除胚胎主动释放的可能性外，主要存在两种观点，一种可能的来源是胚胎细胞受损：囊胚穿刺取样时会在胚胎上形成微小的穿孔，但其破坏性极微，且囊胚穿刺本身不太可能引起胚胎细胞的裂解，但取样之前已损伤或部分溶解的细胞所释放的物质可能会被吸出并分离出来［11，13-14］；另一种可能是来源于污染物质，例如极体、颗粒细胞或精子等。极体带来污染的可能性较小，仅在卵母细胞的挤压下可能释放出极少的遗传物质［15］。为了避免精子污染，大多数研究选择卵泡浆内单精子注射（intracytoplasmic sperm injection，ICSI）受精胚胎来避免影响［16-18］。而颗粒细胞可以在ICSI之前，用透明质酸酶去除，为避免长期暴露于透明质酸酶损害卵母细胞的发育潜能，一些紧密黏附在透明带上的颗粒细胞可以在培养到第3天再次进行剥离。

囊胚液DNA的研究取得了大量成果的同时还存在诸多需要解决的问题，不同研究中囊胚液DNA的扩增水平差异较大［8-11］，还可能存在部分甚至全部基因无法扩增或达不到可检测水平，使得结果分析易受假阳性的影响［19］。而对于已成功进行DNA扩增的样本，其得到的扩增产物在数量和质量上与胚胎活检相比仍有差距［8，10-11］。另外，与单细胞扩增同样面临着不均等扩增和等位基因脱扣等问题。

受到囊胚液本身含量等因素的限制，目前的研究主要围绕核DNA展开，而缺乏对于mtDNA、RNA、蛋白质等物质的探索。有报道称，囊胚液中存在由胚胎分泌的miRNAs，提示供体细胞可能以囊胚液为媒介对受体细胞施加基因调控作用［20］，这可能代表了胚胎存在细胞间通讯机制来调控胚胎的发育过程。

2 胚胎培养基

胚胎培养基是胚胎在体外培养过程中赖以生存的液体环境，能够为胚胎提供各种生长发育所需的必要物质。与囊胚液相比，对胚胎培养基的研究更加丰富和具体，主要是因为取材时间灵活，方法简单，获取样本量相对较大等优点，但同样存在来源、机制以及扩增水平等问题，缺点是更易受到污染。胚胎培养基各成分明确，同时还能够接收来自胚胎释放和代谢的产物，与胚胎有着密切的关系，因此在胚胎发育的关键节点选择性地对目标物质进行检测能够反映胚胎的代谢能力以及发育潜能等信息，有助于胚胎的筛选。近些年来主要在核酸及蛋白质等方面进行了大量的研究。

2．1 核酸 有研究表明，在胚胎培养基中能够检测到核 DNA 和 mtDNA［16-18，21］。Stigliani等［16］利用微阵列比较基因组杂交（array comparative genomic hybridization，aCGH）技术证明胚胎培养基中存在Y染色体。Wu等［18］认为胚胎培养基可用于检测某些单基因疾病，对α-地中海贫血分析的结果显示，胚胎培养基诊断效率（89%），介于卵裂球活检（82．1%）以及囊胚活检（100%）的诊断效率之间。最近的一项研究对突变的IVS-II-654位点和SNP连锁的分析证实，培养基中存在的DNA起源于胚胎细胞［22］。Stigliani等［16］利用卵裂阶段胚胎培养基对mtDNA进行分析，结果mtDNA的检出率为99%，高于同样本群的核DNA检出率（63%），且mtDNA的含量也更高，这可能与胚胎分裂程度的增加以及分裂期细胞质的损失有关。另外还发现，这种现象对于35岁以上的患者尤其明显，表明女性年龄与胚胎培养基中mtDNA的水平可能存在相关性［16］。同一组的一项后续研究发现第3天培养基中较高的mtDNA/核DNA代表了具有少量碎片的高质量以及高着床率的胚胎［17］。

RNA的研究相对较少，Capalbo等［23］在胚胎培养基中找到两种起源于滋养外胚层的miRNAs，认为是筛选整倍体胚胎植入的潜在候选生物标志物。此外，Kropp等［24］研究发现miR-24能够抑制胚胎的发育，而在发生退化的胚胎培养基中可以检测到较高的表达水平，说明miR-24可能被用于评估胚胎的质量。

目前对于胚胎培养基中的遗传物质检测还存在一定的问题和缺陷，不仅需要进行严谨的研究来充分阐明DNA的确切来源及主要机制，还需要解决潜在的污染问题，包括在培养期间环境中的污染，以及由颗粒细胞或精子等引起的污染。例如Assou等［21］的研究以是否扩增出TSPY1基因来界定胚胎性别，但有可能因为样本DNA含量不足而导致扩增失败，进而出现错误的性别判断；Wu等［18］在单基因病检测中添加了空白培养基作为对照，但仍未能充分排除颗粒细胞等污染来源的可能。此外，对相同的胚胎群同时进行胚胎培养基和囊胚液的相关检测可能会有所发现，因为它们之间很可能存在某些关联和相似的机制。

2．2 蛋白质 胚胎质量还可以利用培养基中的蛋白质来评价，了解胚胎对蛋白质的利用及释放的情况，从不同的角度获取胚胎发育的相关信息。胚胎培养基中含有多种蛋白质成分，包括可溶性人类白细胞抗原G（sHLA-G）、胰岛素样生长因子（IGFs）及血小板活性因子（PAF）等。sHLA-G是非经典的HLA-Ⅰ类抗原，在母胎免疫耐受中起着重要作用。Verloes等［25］通过免疫荧光技术检测发现胚胎期各个阶段均有sHLA-G的表达。Rembmann等［26］对多中心的胚胎培养基进行大样本随机检测表明，sHLA-G的表达与卵裂期胚胎具有明显的相关性。Sher等［27］发现培养基中sHLA-G与移植后的妊娠率呈正相关，而最近的一项Meta分析也证实：具有sHLA-G的胚胎培养基与临床妊娠率显著相关［28］，这表明sHLA-G可能成为评价胚胎发育质量的一个重要潜在指标。IGFs是一种具有多种生物学活性的蛋白多肽物质，在植入前胚胎的各个时期均有表达［29］，有促进胚胎发育的作用［30］。Pantaleon 等［31］认为IGF可能促进胚胎对葡萄糖的摄取进而提高胚胎发育质量及着床能力，因而胚胎分泌到培养液中的IGF水平具有一定的参考价值。PAF属于磷脂类物质，具有广泛的生物活性［32］。PAF可以调节胚胎的发育能力，促进细胞分裂和囊胚的形成，而分泌高水平PAF的胚胎更易于妊娠［33-34］，其机制可能是调节胚胎对葡萄糖和乳糖的代谢来影响发育［35］。另外，脂质运载蛋白-1、载脂蛋白A1和白血病抑制因子都被认为与胚胎的发育质量有关。脂质运载蛋白-1在非整倍性囊胚中分泌量增大［36］，载脂蛋白A1在形态学分级较高的胚胎培养基中含量也更高［37］。

2．3 其他具有潜在应用价值的物质 氨基酸作为蛋白质的基本构成单位在胚胎发育的过程中也起着重要作用。Houghton等［38］首次利用液相色谱-质谱联用技术对发育潜能较好的胚胎进行氨基酸测定，发现在这些胚胎中氨基酸均处于较低的代谢水平。Nadal-Desbarats等［39］应用质子磁共振技术检测胚胎培养基也证实了上述结论。另外，还有学者发现氨基酸的含量与妊娠率有一定的相关性［40］，不同性别的胚胎对氨基酸的利用率也有差异［41］。虽然对于氨基酸的研究较多，但对哪些与胚胎状态之间具有相关性仍缺乏统一的认识，因此何种氨基酸适用于胚胎筛选仍需要更多高水平的研究来确立。

除核酸与蛋白质类物质外，胚胎培养基中还有一些其他种类物质可以用于胚胎质量评价，如在胚胎培养基中HCG的含量与妊娠率呈正相关［42］，CD146 与移植成功率呈负相关［43］。另外，碳水化合物为胚胎提供了能量来源，早期主要由丙酮酸和乳酸提供，而在随后的发育过程，逐渐转变为葡萄糖提供，不同阶段的能量代谢特征能反映胚胎的发育潜能［44］。

3 胚胎形态的延时成像

目前常规培养系统主要以伊斯坦布尔共识［1］为依据，在特定的时间点根据胚胎静态的形态学描述进行评级。但胚胎发育是一个连续的过程，选取特定的几个关键时间点观察虽然能描述胚胎发育的大致轮廓，但无法给出具体的原核消失的时间、卵裂时间、卵裂模式等数据，而这些数据对评估胚胎发育潜能具有重要的指导意义［45-46］。在操作上，传统形态学观察需要反复开箱来观察胚胎的状态，观察节点越多对评价越有利；而每次观察都会给胚胎带来温度、湿度及气体等环境条件的改变，对胚胎的微环境产生影响，这反过来又要求尽量降低观察频率，这种矛盾使得传统形态学难以突破自身局限性。同时，形态的评估会受到主观因素的影响，因为胚胎在单一时间点上所展现的形态可能不够典型［47］，导致大多情况下只能继续培养监测；然而，胚胎体外培养时间有限，未必有充足的时间用来观察。延时成像技术将高分辨率瞬时曝光摄像元件与胚胎培养装置整合，每间隔一定的时间自动对胚胎进行拍摄并合成动态画面，并通过与摄像器材相连的计算机来记录胚胎的发育情况以及相应的时间节点资料［48］。这样不仅维持了观察过程中胚胎所处环境的稳定［49］，而且还能够自动保存复杂的数据和胚胎图像，用以分析卵裂模式、卵裂时间、卵裂同步性等传统形态学无法记录的信息，大大扩增了观察资料和分析的灵活性［50-51］。

卵裂模式主要从卵裂均等性、卵裂倍增性（单细胞分裂后生成的细胞数量，正常单个细胞分裂后生成两个子代细胞）、卵裂球融合、卵裂停滞等方面对胚胎发育进行评价。有研究证明，卵裂倍增异常的胚胎囊胚形成率（11．7%）和种植率（3．7%）较低［52］，而流产率较高［53］，可能是异常的卵裂模式造成非整倍性及多核率显著增高［54］，甚至胚胎染色体异常，进而导致妊娠率降低及流产率升高的发生［55］。卵裂停滞为胚胎出现1个或以上卵裂球的长时间停止分裂的现象，可能是由于调控胚胎发育的过程中出现了障碍，此类胚胎多为非整倍体或嵌合体胚胎［56］。而卵裂球融合的出现也不利于胚胎的发育，此类胚胎囊胚形成率极低，发育潜能低下［57］。在对胚胎多核性进行分析中发现，带有非正常核数的卵裂球多为非整倍体，胚胎移植潜能低，而该现象只有在卵裂特定时期才能观察到，常规的观察方法会漏掉70%以上，因此延时成像技术能够有效避免多核卵裂球胚胎的移植［58］。卵裂时间主要研究卵裂期细胞数与对应培养时间的关系以及处于某一细胞数所持续的时间，进而对两个形态学评级相同的胚胎可能观察到完全不同的发育过程。Wong等［59］研究结果表明，受精卵发育至2细胞所需时间可预测胚胎的质量和种植力。Meseguer等［60-61］进一步研究认为卵裂球维持2细胞状态的时间≤11．9 h表明胚胎着床能力较高。在受精后（68±1）h正常的胚胎细胞数应为8个［45］，而其他细胞数的胚胎可能存在分裂异常、细胞融合、碎片化等问题，可能最终影响胚胎整体的发育潜能［62］。此外，还有研究表明原核消失时间较早的胚胎发育潜能较好［63］。

延时成像很好地弥补了传统形态学评级的不足，在传统形态学数据的基础上提供大量的相关资料，同时还避免了反复开箱等对胚胎有影响的操作，为提高植入前胚胎的质量提供了可行的方案。因此与胚胎液体环境的检测相比，该技术更具有现实的可行性，更容易被临床接受。但有报道显示，频繁的曝光会对胚胎的发育造成一定的不良影响［64］，原因可能是诱发细胞膜上的不饱和脂肪酸与类脂产生氧化反应，从而导致细胞内活性氧簇（ROS）生成增多所致［65］。大量的ROS可导致细胞内DNA及其他重要结构被破坏，从而对胚胎发育产生负面影响，因此，一般选用细胞敏感度较低的光源以及合理的曝光频率来减低光源性的影响。

4 总结与展望

虽然胚胎的构成比较简单，但其发育潜能巨大，单一的形态学指标不足以预计胚胎的最终结局，而在多水平、多维度进行综合评价也许是更有效的手段。无创的方法可以避免活检对胚胎造成的无法预知的影响，但并非一定要取代有创操作，其最主要的目的是增加评估方法的多样性和选择性，从多角度预测胚胎的发育情况，为胚胎筛选提供更准确依据。然而，并非筛选条件越多效果就会越好，复杂的筛选条件不仅面临着更多的操作风险，还会导致更多的胚胎被剔除，这使得获取胚胎数量较少的患者可能无优质胚胎移植，因此，合理利用筛选方法并确保高水平的准确性和敏感性十分重要。另外，还应不断提高胚胎培养的整体质量水平，为筛选提供更有利的条件。