敲除鼻咽癌SU NE-1-6-10 B细胞株中的K i SS-1基因对裸鼠肺转移的影响

张磊，江浩

（蚌埠医学院第一附属医院放疗科，安徽 蚌埠 233000）

目前，鼻咽癌经治疗后的5年生存率在70%左右，引起治疗失败的主要原因是癌细胞的局部破坏和远处转移。其中，因远处转移导致的治疗失败占失败总数的35%～46%。KiSS-1基因是Lee等［1］发现的一个转移抑制基因，定位于人类染色体1q32-q41，其表达产物（Kisspeptin）可以明显抑制恶性黑色素瘤细胞的浸润和转移能力。近年来的研究表明，该基因的表达与胰腺癌［2］、滋养层细胞肿瘤［3-4］、泌尿上皮肿瘤［5-6］、肝癌［7］、非小细胞肺癌［8］、乳腺癌［9-10］等恶性肿瘤的转移紧密相关。但KiSS-1基因与鼻咽癌转移的关系却鲜有报道。

本实验利用CRISPR/Cas9基因敲除技术［11-12］对低转移能力的SUNE-1-6-10B鼻咽癌细胞株进行KiSS-1基因敲除实验，其基因敲除是否成功采用Surveyor法和Western blot技术从基因和蛋白表达水平进行验证。最后，将KiSS-1基因敲除的细胞株和正常的鼻咽癌细胞株分别接种于裸鼠腋下，观察其成瘤和肺转移情况，揭示KiSS-1基因与鼻咽癌肺转移的关系，从而推断KiSS-1基因对鼻咽癌肺转移的影响，为临床中预测鼻咽癌患者是否发生转移、个体化治疗以及应用肿瘤转移抑制基因进行早期干预治疗提供理论基础。

1 材料与方法

1．1 材料 SUNE-1-6-10B细胞株（中科院上海细胞库），RPMI 1640培养基（美国Thermo公司），胎牛血清（美国Gibco公司），慢病毒LVCas9-Puro和LV-sgRNA-EGFPMCS（上海吉凯基因化学技术有限公司），Surveyor检测试剂盒（上海吉盛医学科技有限公司），Western blot试剂盒（碧云天生物技术研究所）。

1．2 实验动物 40只BALB/c-nu裸鼠，4～6周龄，雌性，购买于北京维通利华实验动物技术有限公司。生产许可证号SCXK（京）2012-0001，合格证号11400700092857。

1．3 方法

1．3．1 细胞培养与慢病毒转染 用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基培养SUNE-1-6-10B细胞，37℃5%CO2培养箱中恒温培养。转染前将SUNE-1-6-10B细胞种于6孔板中，待细胞密度达到60%～70%时进行转染。

针对KiSS-1基因作用的功能域设计CRISPR／Cas9作用靶点，构建sgRNA的表达质粒。sgRNA序列的设计参考哈佛大学张峰实验室提供的网站（http：//crispr．mit．edu/）。sgRNA 序列为5'-GGGAACCACGGCAGAAGCGC-3′。本实验使用的LV-Cas9-Puro（带有嘌呤霉素标记）和LV-sgRNA-EGFPMCS（带有绿色荧光标记）均由上海吉凯基因化学技术有限公司合成。

转染过程：将SUNE-1-6-10B细胞密度调整至4×104/ml，吸取细胞悬液至6孔板，每孔2 ml。1 d后，将LV-Cas9-Puro慢病毒悬液（2×108TU/ml，75 μl）、Eni．S 溶 液（80 μl）和 polybrene 溶 液（10 μl）加入其中，于37 ℃ 5%CO2培养箱培养。转染3 d后使用浓度为0．6 μg/ml嘌呤霉素溶液筛选转染细胞。最后，将LV-sgRNA-EGFPMCS慢病毒悬液（2×107TU/ml，125 μl）和 polybrene溶液（10 μl）加入其中，于37 ℃ 5%CO2培养箱培养，定期更换培养液。

1．3．2 Surveyor法检测 根据DNA提取试剂盒中的步骤，提取慢病毒转染后的SUNE-1-6-10B细胞基因组。基因组DNA加入上下游引物，进行PCR扩增。设计的PCR扩增引物，上游引物：5'-TGCACCGAGAGGAAGCCAGCTGCTA-3'，下 游引物：5'-CGCAGACCACACGTCAGTGAGTTAC-3'。酶切筛选阳性克隆：在灭菌PCR管中配制反应体系：PCR 产物 3．0 μl、Detecase Buffer 2．0 μl、Detecase 1．0 μl、蒸 馏 水 4．0 μl，45 ℃ 反 应 20 min。结束后，立即向上述10 μl体系内加入2 μl终止液，随后进行2%琼脂糖凝胶，105 V 25 min电泳检测。电泳过程中注意观察内标（Marker），待其条带明显分开后，结束电泳。小心取出凝胶，将其放于UVP凝胶成像仪（美国 Bio-Rad公司，VersaDoc 3000）中。调整参数，观察电泳结果。

1．3．3 Western blot检测 利用含蛋白酶抑制剂（美国Sigma公司）的裂解缓冲液裂解细胞悬液。使用BCA蛋白定量试剂盒（天根生化科技有限公司）对提取的蛋白进行定量。取相同质量的蛋白质（40 μg）电泳分离，电转膜仪转膜，封闭后加入一抗：抗KiSS-1抗体（美国Santa Cruz公司），β-Actin（美国Santa Cruz公司），4℃孵育过夜，加入二抗。ECL显色液显色，分析比较记录。

1．3．4 SUNE-1-6-10B细胞接种裸鼠腋下，观察肺转移灶情况 实验组20只裸鼠使用0．2 ml浓度5×106/ml Kiss-1基因敲除的SUNE-1-6-10B细胞株接种于腋下；对照组20只裸鼠使用0．2 ml浓度5×106/ml KiSS-1基因未敲除的SUNE-1-6-10B细胞株接种于腋下。裸鼠全部被饲养于无特殊病原体（SPF）环境。25 d后，经颈椎脱臼法处死裸鼠，并将裸鼠的腋下肿瘤和肺脏取出，测量腋下肿瘤的重量，计录出现肺部转移灶裸鼠只数。

1．4 统计学方法 采用SPSS 13．0统计学软件进行数据分析，以［n（%）］表示计数资料，组间比较采用χ2检验；采用均数±标准差表示计量资料，组间比较采用t检验。α＝0．05为检验的标准，P＜0．05为差异有统计学意义。

2 结果

2．1 KiSS-1基因敲除细胞株的建立 细胞株平均2～3 d传代一次，细胞形态正常，生长良好，见图1。

图1 倒置光学显微镜下的SUNE-1-6-10B鼻咽癌细胞株

CRISPR/Cas9双载体慢病毒体系通过2个慢病毒载体分别向细胞导入Cas9蛋白和sgRNA序列表达框，依次转染LV-Cas9-Puro和LV-sgRNAEGFPMCS后，将细胞培养瓶置于荧光显微镜下，可见慢病毒转染效率＞95%，见图2。

图2 白光下（×200）和荧光显微镜下（×200）同一视野的鼻咽癌细胞用于观察慢病毒转染效率

2．2 Surveyor验证 结果显示在实验组和对照组均能检测到与预计大小相符的目的条带。经错配酶消化后，在实验组（转染LV-Cas9-puro/LV-sgRNA-EGFPMCS）的电泳结果显示出现2条额外的231 bp和190 bp的片段，与预计大小相符。见图3。

图3 KiSS-1基因敲除成功与否的Surveyor验证

2．3 Western blot检 测 KiSS-1基 因 通 过CRISPR/Cas9技术敲除后，先提取Kisspeptin蛋白，再用Western blot的方法完成对该蛋白含量的检测。结果发现Kisspeptin蛋白在敲除了KiSS-1基因的鼻咽癌细胞中呈低表达。见图4。

图4 Western blot检测Kisspeptin蛋白含量

2．4 裸鼠腋下移植瘤以及肺组织转移灶 裸鼠腋下接种人鼻咽癌细胞株25 d后，将裸鼠处死，检查发现腋下成瘤率为100%，见图5。

实验组、对照组裸鼠腋下移植瘤平均重量分别为（6．72±0．37）g、（6．80±0．38）g，差异无统计学意义（P＞0．05）。实验组20只裸鼠中有8只裸鼠出现肺转移灶，肺转移率为40%；对照组20只裸鼠中有2只裸鼠出现肺转移灶，肺转移率为10%，差异有统计学意义（χ2=4．800，P＜0．05）。

图5 裸鼠腋下移植瘤以及肺组织转移灶

3 讨论

与其他恶性肿瘤一样，鼻咽癌患者治疗期间的远处转移成为临床治愈的一大障碍，而目前对于鼻咽癌转移的治疗手段相对匮乏，所以研究鼻咽癌远处转移治疗的新方法就显得格外迫切。

KiSS-1基因是众多转移抑制基因之一，其转移抑制作用最先发现于人黑色素瘤细胞。该基因转录翻译生成的Kisspeptin蛋白在恶性肿瘤的发生、转移以及生殖功能调节等方面都起着重要作用。

本课题组前期的研究表明，KiSS-1基因在非肿瘤性鼻咽上皮高表达，而在鼻咽癌组织中表达降低，KiSS-1基因表达降低会增加鼻咽癌患者的转移机率［13］。后续的实验研究结果进一步表明，在低转移能力的SUNE-1-6-10B细胞株中KiSS-1基因在mRNA水平和蛋白质水平的表达都显著高于其他具有较高转移性细胞株中的表达［14］。

CRISPR/Cas9技术是近年来一种新兴的基因敲除技术。国内外很多学者已经用此种方法对目标靶基因成功进行了敲除。但鲜有学者对KiSS-1基因进行敲除，并揭示KiSS-1基因缺失与肿瘤转移的关系。

本实验使用的鼻咽癌细胞经敲除KiSS-1基因后，经Surveyor法验证，实验组和对照组均能检测到与预计大小相符的目的条带。经错配酶消化后，实验组电泳后出现2条额外的231 bp和190 bp的片段，与预计大小相符，说明部分鼻咽癌细胞的基因组序列因为产生了由CRISPR/Cas9系统诱发的随机插入或删除的非同源重组的末端修饰，从而导致基因组突变，而在PCR产物经缓慢退火时不能完全配对，因此能被错配酶识别从而切断成2条小的DNA片段，证实CRISPR/Cas9系统成功在SUNE-1-6-10B细胞基因组上导致定点突变。与此同时，Western blot检测结果发现，基因敲除后的鼻咽癌细胞表达Kispepttin蛋白明显减少，说明基因敲除导致转录生成的mRNA减少，进而翻译生成的蛋白质也将相应减少。最后的裸鼠移植瘤实验结果表明，在敲除KiSS-1基因后，皮下移植瘤的大小未出现差异，而肿瘤肺转移灶的个数有所提升，这说明KiSS-1基因对肿瘤的成瘤无明显影响，而对于鼻咽癌细胞肺转移具有一定的抑制作用。

本实验为研究KiSS-1基因对鼻咽癌细胞株的转移性进行了一次有益的尝试，为临床上鼻咽癌肺转移患者的靶向治疗提供了一定的实验基础。