人脂肪干细胞的分离、培养及鉴定

李玉秋，张雷雷，黄飞

（山东华思生物科技有限公司，山东 烟台 264003）

脂肪干细胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）是2001年Zuk等［1］从真空吸脂术抽出的脂肪中发现的一种间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs），其含量约占脂肪组织的10%～20%［2］。ADSCs同其他 MSCs一样，具有自我更新和多向分化的潜能，是成体干细胞的一种，在疾病治疗领域有巨大的潜力。但ADSCs较骨髓干细胞有更高的提取率，其提取率可高达1%～2%，是骨髓干细胞的1 000倍［3］。ADSCs已成为研究者们青睐的种子细胞，本文就ADSCs的提取、培养和鉴定进行研究。

1 材料与方法

1．1 材料

1．1．1 脂肪组织 选取滨州医学院附属医院产科剖宫产产妇皮下脂肪组织，产妇无其他基础疾病，未经过特殊药物治疗，取材前均获得医院伦理委员会批准和产妇知情同意。

1．1．2 试 剂 低 糖 DMEM 培 养 基（Gibco，美国）、胎牛血清（FBS，Hyclone，美国）、Ⅰ型胶原酶（索莱宝，中国）、胰蛋白酶（Gibco，美国）、磷酸盐缓冲液（PBS，Hyclone，美国）、青霉素-链霉素（索莱宝，中国）、CD44-FITC抗体（eBioscience，美国）、CD105-PE（eBioscience，美国）、CD34-APC抗体（eBioscience，美国）、CD45-PerCPCyanine5．5抗体（eBioscience，美国）。

1．1．3 仪器 CO2培养箱（Thermo Scientific，美国）、生物安全柜（香港力康，中国）、低速多管大容量离心机（上海安亭，中国）、手术器械（新华，中国）、70 μm细胞筛网（索莱宝，中国）、细胞培养皿（Corning，美国）、超低温冰箱（Thermo Scientific，美国）、流式细胞仪（BD，美国）等。

1．2 方法

1．2．1 ADSCs提取 （1）将无菌条件下用真空抽脂术提取的腹部皮下脂肪，在生物安全柜内取约5 g，用含有500 U/ml双抗的PBS充分漂洗3遍，剔除肉眼可见的血管及结缔组织，用眼科剪将其充分剪碎，再用PBS反复冲洗，尽量除去红细胞。（2）加入2倍体积的0．2%Ⅰ型胶原酶，振荡混匀后，于37℃的恒温水浴箱消化60 min。（3）加入等体积的含有10%FBS的低糖DMEM培养基终止消化。（4）1 800 r/min离心10 min（离心后分为3层，上层为油脂及未消化完全的脂肪组织，中层为上清液，下层为脂肪干细胞和红细胞等混合细胞的沉淀）。（5）弃上层和中层，加入2 ml完全培养基（低糖DMEM+10%FBS+100 U/ml青霉素-链霉素）重悬细胞沉淀，70 μm细胞筛网过滤，将滤过后的滤液调整细胞浓度为1×108/L接种至60 mm细胞培养皿中，于37℃5%CO2细胞培养箱中培养。

1．2．2 ADSCs培养、传代 将提取的原代ADSCs培养24 h后进行半量换液，48 h后进行全量换液，去除残存的红细胞、细胞碎片等。之后每2 d换液1次，获得纯化后的ADSCs，培养7～9 d后，原代ADSCs可生长融合达到90%，用0．25%胰蛋白酶（含有0．2%EDTA）常规消化后，1∶3传代接种到新的细胞培养皿中持续体外扩增培养。

1．2．3 流式细胞术鉴定ADSCs标志物 取第3代ADSCs鉴定细胞表面特异性标志物CD34、CD44、CD45、CD105，实验步骤：（1）ADSCs用胰酶消化后，1 000 r/min离心4 min，用PBS重悬，计数，每个2 ml EP管取细胞3×105个细胞，1 000 r/min离心 4 min，弃上清，加入 50 µl或100 µl PBS重悬。（2）细胞与抗体孵育：a.空白细胞对照组：加入50 µl PBS；b.加入1 µl CD44-FITC抗体+99µl PBS；c.加入2.5µl CD105-PE抗体+47.5µl PBS；d.加入2.5µl CD34-APC抗体+47.5 µl PBS；e.加入 2.5 µl CD45-PerCPCyanine5.5抗体+47.5 µl PBS；f.将上述4种抗体分别取1 µl、5 µl、5 µl、5 µl加入细胞中+84 µl PBS。4℃避光孵育45 min（每隔15 min摇晃1次）。（3）孵育完后，加入1 ml PBS重悬，1 000 r/min离心4 min，弃上清，加入1 ml PBS再洗一遍，最终加入200µl PBS重悬。（4）应用流式细胞仪进行检测。

2 结果

2．1 ADSCs提取 通过胶原酶法提取得到了ADSCs，提取过程见图1A。提取的原代ADSCs生长状况见图1B-F。ADSCs呈贴壁生长，随着培养时间的增加，其呈现出纤长的纤维细胞样。

图1 原代ADSCs的提取

2．2 ADSCs培养 传代后的ADSCs接种24 h后，细胞已贴壁，呈圆形、短梭形或者多角形，大小不一；待细胞进入增殖期时，ADSCs逐渐伸展呈现长梭形，排列紧密，呈漩涡状生长，细胞形态与成纤维细胞相似，大小均一，多角形及圆形细胞少见，见图2。

图2 光镜下观察原代ADSCs的培养（×100）

2．3 ADSCs鉴定 成熟后的ADSCs，用流式细胞术鉴定ADSCs的细胞表面特异性标记物，发现CD44和CD105表达阳性，CD34为低表达，CD45表达为阴性，见图3。

图3 流式细胞术鉴定ADSCs的特异性标记物

3 讨论

ADSCs是从脂肪组织中提取出来的具有多能分化潜能的成体干细胞，拥有来源充足、取材方便、操作简单、体外易培养、生物学性状稳定、免疫原性低、不受伦理学限制等优点，因此是组织工程学应用较为广泛的的种子细胞［4］。随着细胞治疗的发展，ADSCs在治疗、康复、美容等领域均具有较大的应用潜力。ADSCs作为人体组织工程中最大的成体干细胞库，将成为干细胞应用领域中理想的细胞来源［5］。

ADSCs提取方法有很多，刘琴等［6］对其提取分离方法进行总结，主要包括了组织块贴壁法、胶原酶消化法、机械分离法（直接离心法、震荡离心法、旋涡离心法、吸附柱法、超声处理法）、胶原酶结合组织块贴壁法、悬浮培养法等，其中胶原酶消化法提取的ADSCs，其转化成骨的的能力更强［7］。采用胶原酶法消化离心脂肪组织所获得的沉淀称为基质血管成分（stromal vascular fraction，SVF），SVF中除了需要的ADSCs外，还有脂肪前体细胞、成纤维细胞、周细胞、基质细胞、内皮细胞、内皮祖细胞、造血干细胞、血管平滑肌细胞、免疫细胞等［3］。因为SVF中大多数细胞在培养液中处于漂浮状态无法贴壁［8］，所以胶原酶法提取的SVF原代培养48 h，再经换液后，获得的所有的贴壁活细胞均为ADSCs［9］。为了进一步鉴定ADSCs，特异性的标记物是最理想的条件，但是由于各种因素的影响，目前尚未明确ADSCs的特异性标记物［10］。2013年，国际脂肪治疗科学联合会（IFATS）和国际细胞治疗学会（ISCT）联合宣布：ADSCs新分离的表型为CD31-/CD34+/CD45-/CD235a-，而体外培养表型为CD31-/CD44+/CD45-/CD73+/CD90+/CD105+［11］，也有研究发现CD34为低表达［12-13］。本研究发现，采用胶原酶法可以很好地提取ADSCs，经过原代培养换液，可以获得较纯的ADSCs，且经过流式细胞术鉴定后，发现其表面标志物为CD34+/CD44+/CD45-/CD105+，其中CD34为低表达。

通过本研究发现，采用消化酶法可以成功提取ADSCs，且其性状相对稳定，易于培养。通过流式细胞术鉴定其表面标记物，可证明本研究提取的细胞为ADSCs。用此方法可以较便捷地提取ADSCs，便于后续的转化分析的研究。

（致谢：感谢滨州医学院附属医院产科提供正常产妇来源的腹壁皮下脂肪）