EV71手足口病患儿CD8＋T、NK细胞穿孔素和颗粒酶B的变化

姜 涛，欧阳文献，谭艳芳，李双杰

（湖南省儿童医院，湖南 长沙 410007）

手足口病主要由柯萨奇A组16型（CoxAl6）、肠道病毒7l型（enterovirus 71，EV71）［1］引起的急性出疹性传染病，大部分患儿预后良好，少数病例可出现脑干脑炎、脑膜炎、脑脊髓炎、急性迟缓性瘫痪、肺水肿、循环障碍甚至死亡［2］。EV71型手足口病可导致机体发生多种复杂的免疫功能变化［3］，且EV71患儿更容易出现急性肺水肿和中枢神经系统损伤，致死及致残率相对更高［4］。研究表明，手足口病的发病与病毒直接侵犯细胞、HLA-A2宿主基因的易感性［5］、机体免疫功能的变化等有关［6］，而抗原提呈细胞处理抗原片段后激活NK细胞和Tc细胞，通过分泌颗粒酶穿孔素直接杀伤靶细胞［7］，在抗病毒中起着重要重要。故本研究采用流式细胞术检测EV71型手口足病患儿体内CD8＋T、NK细胞中穿孔素（perforin，PRF）和颗粒酶 B（granzyme B，GrzB）的变化，为探索EV71型手足口病发病机制提供新的依据。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选择2017年5—7月湖南省儿童医院感染科住院治疗的手足口病患儿60例，其中普通型手足口病患儿30例（普通型组），重型手足口病患儿30例（重型组），手足口病的诊断标准参照卫生部制定的《手足口病预防控制指南（2010年版）》［8］，其诊断标准为：（1）轻型病例，手、足、口、臀部皮疹，伴或不伴发热。（2）重症病例，出现神经系统受累表现，如精神差、嗜睡、易惊、谵妄、头痛、呕吐、肢体抖动、肌阵挛、眼球震颤、共济失调、眼球运动障碍，无力或急性弛缓性麻痹，惊厥，可见脑膜刺激征，腱反射减弱或消失。且EV71-IgM阳性，排除其他肝炎病毒，EB病毒等感染。同时选择本院体检的健康志愿者30例作为健康对照组，年龄1～6岁，EV-71抗体阴性，无心、肝、肾、消化道病和神经等系统疾病及代谢异常史。

1.2 伦理和知情同意 研究经过本院伦理委员会审查并通过。所有研究对象在纳入研究前，均获得患儿监护人同意，并签署相关知情同意书。

1.3 材料与方法

1.3.1 主要试剂 PE／Cy 7 anti human CD56（Biolegend公司），Cytofix／CYTOPERM BUF KIT，CD3-PerCP荧光单克隆抗体试剂和CD8-FITC、hu perforin Alexa 647 Dta G9 和 hu Granzyme B PE MAB均购自美国BD公司。

1.3.2 检测方法 流式细胞术检测PRF和GrzB表达水平：采集被研究者外周静脉血2 mL，置于EDTA抗凝管中（12 h内处理），采用人外周血淋巴细胞分离液分离单个核细胞（PBMNC），加入以下表 面 抗 体 进 行 染 色，anti-CD3-PerCP、anti-CD8-FITC、anti-CD56-APC（CD3＋CD8＋CTL 细胞、CD3-CD56＋NK细胞）。常规固定、破膜、洗涤后加人PE标记的PRF或GrzB抗体，或其相应的同型抗体，室温下避光孵育1 h后洗涤，24 h内上流式细胞仪（美国BD公司FACS CANTOII产品）进行分析，以PRF或GrzB阳性细胞率表示PRF或GrzB水平。

1.4 统计方法 应用SPSS 18.0软件处理数据，所得数据均采用均数±标准差（珚±s）表示，采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CD8＋T细胞PRF、GrzB的变化 与正常对照组相比，普通型组和重型组EV71手足口病患儿急性期CD8＋T细胞PRF、GrzB的表达水平均升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。普通型组和重型组EV71手足口病恢复期患儿CD8＋T细胞PRF、GrzB的表达水平较急性期明显下降，但仍高于正常组（P＜0.05）。见表1。

表1 普通型组和重型组EV71型手口足病患儿体内CD8＋T细胞PRF、GrzB的变化Table 1 Changes in PRF and GrzB in CD8＋ T cells in children with common and severe EV71 HFMD

2.2 NK细胞PRF、GrzB的变化 与正常对照组相比，普通型组和重型组EV71手足口病患儿急性期NK细胞PRF、GrzB的表达水平均升高，差异有统计学意义（均P＜0.05）。EV71手足口病患儿急性期NK细胞PRF、GrzB的表达水平：普通型组和重型组比较，差异均无统计学意义（均P＞0.05）。普通型组EV71手足口病恢复期患儿NK细胞中PRF、GrzB的表达水平较急性期虽稍升高，但差异仍无统计学意义（均P＞0.05）。重型组EV71手足口病恢复期患儿NK细胞中PRF、GrzB的表达水平较急性期明显升高（均P＜0.05）。见表2。

表2 普通型组和重型组EV71型手口足病患儿体内NK细胞PRF、GrzB的变化Table 2 Changes in PRF and GrzB in NK cells in children with common and severe EV71 HFMD

3 讨论

EV71是一种新型肠道病毒，自1969年首次被分离鉴定后，1973年才被认为与手足口病相关。EV71引起的手口足病以重型多见，3岁男性患儿为主［9］，夏秋季节好发［10］。近几十年来，EV71在全球连续暴发，威胁到儿童的健康和生命［11］。

EV71感染后可致机体极其复杂的免疫功能变化，出现固有、细胞和体液免疫功能紊乱，与疾病的进展及严重程度有关。而机体对病毒的有效识别和清除依赖于天然免疫和获得性免疫的相互补充和协作，作为固有免疫的主要细胞NK细胞，是机体免疫防御系统的第一道防线。研究［12］表明，EV71感染导致外周血NK细胞数目显著减少，功能减弱甚至缺陷，从而加快病程的发展。另外，细胞免疫在抗病毒中亦起到关键作用。EV7l感染后，缺乏CD4＋或CD8＋T细胞的小鼠发生了更严重的疾病［13］。与正常对照组相比，手足口病患儿总T细胞、CD4＋T细胞数量减少，CD4＋／CD8＋比值降低，表明EV71感染导致患儿细胞免疫功能紊乱，重症病例尤为明显［3，14－15］。由此可见，CD8＋T 细胞和 NK 细胞在机体抗EV71中起着重要作用。

CD8＋T细胞和NK细胞中有两个主要的细胞杀伤机制，一个是Th细胞表明抗原Fas配体L（Fas L）和Fas靶细胞表面抗原的相互作用［16］。另一个是颗粒胞外分泌通路，PRF以及其他介质从细胞内释放出来后，与靶细胞膜结合，并嵌入膜内，形成一个中空的多聚体，导致膜的完整性受损，水分子、离子以及其他的小分子进入靶细胞内，使细胞内渗透压改变而造成细胞死亡［17］。颗粒酶在PRF协同作用下通过颗粒胞吐作用（granule exocytosis）释放进入靶细胞之间形成的免疫突触中，然后进入靶细胞的细胞质，并在细胞核聚集，诱导一种叫天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶（caspases）的非依赖性细胞死亡，迅速清除细胞内的病原体和有病变的细胞［18］。研究表明，PFN基因敲除小鼠感染流感病毒A后，肺内病毒大量繁殖，病毒清除时间延长，NK和CTL杀伤活性显著降低，提示PFN在控制流感病毒感染中起着重要作用［19］，PRF表达的不足，与HBV感染慢性化［19］和 HIV［20］感染相关。由此可见，PRF及GrzB介导的细胞杀伤及细胞毒性作用在病毒感染等疾病中起着重要作用。而目前尚未见PRF及GrzB在EV71手足口病中作用的研究。

本研究中，60例手足口病患儿，经积极抗病毒和对症支持等治疗后，均痊愈出院。普通型和重型手足口病患儿体内CD8＋T和NK细胞中PRF、GrzB的水平明显升高，机体抗病毒作用的增强，有利于病情恢复，而重型手足口病患儿体内CD8＋T细胞PRF及GrzB有所升高，但低于普通型手足口病患儿，由于机体抵抗病毒能力不足，导致病毒大量复制及扩散，免疫细胞持续活化，大量炎症因子释放，加重机体组织损伤，从而导致患儿病情加重。随着患儿病情恢复，普通型和重型手足口病患儿体内，CD8＋T细胞中PRF及GrzB的水平有所下降，但仍高于正常组；NK细胞中PRF、GrzB：重型组恢复期较急性期明显升高，而在普通对照组中无差异，由此可见，CD8＋T和NK细胞在机体恢复期起到持续抗病毒作用，有助于病情的恢复，尤其是NK细胞PRF、GrzB水平的升高，在重型手足口病患儿恢复期中起着重要作用。

综上所述，EV71手足口病患儿体内免疫功能紊乱，重型EV71手足口病患儿的免疫功能紊乱更加明显，早期检测CD8＋T细胞中PRF、GrzB水平，或许可作为判断疾病严重程度的临床指标。本课题由于时间及客观因素并未收集到危重型手足口病病例，无法全面了解其在EV71手足口病中的作用，有待于进一步研究。