利用生物信息学探索介导鲍曼不动杆菌血流感染的相关蛋白

冯文艳，张扣兴

（中山大学附属第三医院，广东 广州 510530）

鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii，AB）为非发酵革兰阴性杆菌，有荚膜和菌毛，无鞭毛，定植远多于感染，属于条件致病菌［1］，主要引起呼吸道感染，也可引发败血症、泌尿系统感染、继发性脑膜炎等，是医院感染的重要病原菌，其中ST92型（此为Bartual方案分型，与法国巴斯德研究所方案中ST2型对应）是世界上分布最广的ST型［2］。近年来，AB的感染不断增多，且其耐药性日益严重，多重耐药鲍曼不动杆菌 （MDR-AB）、泛耐药鲍曼不动杆菌 （PDR-AB）、耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌（CRAB）等广泛传播，给治疗带来很大挑战。临床观察及临床数据调查显示，AB感染在重症监护病房（ICU）普遍存在［3－4］，与单纯的肺部感染相比，血流感染治疗极为困难，患者病死率高、预后差，且与耐药性无明确相关性，耐药性高的AB若定植于痰，不发生血流感染，则患者预后良好［5］。AB入血的机制尚不清楚，目前，许多研究对AB血流感染的危险因素进行分析，发现深静脉置管、机械通气、粒细胞缺乏等是主要危险因素［6－8］，但AB多发生于ICU或术后患者，大多身体状况较差、免疫力低下，这些危险因素在临床治疗中不可避免，不适当的初始治疗是重要危险因素，早诊断、早治疗是关键［9－10］。临床观察发现，即便是同一多位点序列分型（MLST）的AB感染，进行同样的临床操作（深静脉置管、机械通气等），部分患者仅限于肺部感染，而另一部分患者却更易发生血流感染，推测影响AB血流感染的因素不仅有有创操作、患者自身免疫等外部及患者因素，菌株的生物学特性差异也是重要原因，具体机制尚不清楚。推测找到AB自身侵袭宿主的可能关键蛋白，有助于防治AB血流感染。本研究主要采用生物信息学方法对已报道的AB基因组学进行分析，探索介导AB血流感染的相关蛋白。

1 资料与方法

1.1 菌株资料收集 在AB基因、蛋白数据库（https：／／www.ncbi.nlm.nih.gov／genome／genomes／403？）中对目标菌株进行检索，检索策略为：（1）MLST相同，但是分离部位不同的AB菌株；（2）考虑到AB存在进化，因此菌株分离年份必须相同；（3）考虑AB的地区分布差异，所检索的AB菌株均从中国医院分离；（4）菌株存在完整的基因组学数据，将同一MLST、不同分离部位的AB分为同一组别。

1.2 分析方法 利用在线工具软件（http：／／bioinfogp.cnb.csic.es／tools／venny／index.html），对检索到的相同ST分型AB基因组学数据、蛋白数据进行分析，由于蛋白执行相应的功能，直接介导了AB的不同生物学特性，因此，重点选择蛋白数据进行分析，找出仅存于血流感染AB的特有蛋白。随后，在 Uniprot（http：／／www.uniprot.org／）、UCSC（http：／／genome.ucsc.edu／）、KEGG （http：／／www.kegg.jp／kegg／pathway.html）等数据库对筛选出的特异蛋白进行功能鉴定、聚类分析。

2 结果

2.1 菌株一般信息 在设定的检索条件下，共检索10株AB，其中ST92型4株（分离自血、痰各2株）、ST137型4株（分离自血、痰各2株）、ST365型2株（分离自血、痰各1株）。将10株AB按MLST分为3组，见表1。

表1 10株纳入研究的AB信息Table 1 Information of 10 strains of AB that were included in this study

2.2 蛋白差异分析 对不同组别AB基因、蛋白数据库进行数据分析，结果显示，部分蛋白仅存在于血流感染AB中，不存在于分离自痰的AB中，其中ST92、ST137、ST365型血流感染AB中分别存在20、4、22个特有蛋白。见图1。

图1 3组MLST AB的差异蛋白数据分析结果Figure 1 Data analysis of differential protein of 3 groups of MLST AB

针对仅存在于血流感染AB的特有蛋白进行功能注释、分析，结果发现，存在于ST92型血流感染AB中的20个特有蛋白，其生物学过程主要集中于细菌代谢、DNA合成、DNA损伤及修复、转录翻译、基因转座、以及噬菌体相关蛋白等通路上；存在于ST137型血流感染AB中的4个特有蛋白，其生物学过程主要集中于细菌毒力、细菌代谢、基因转座等通路上；存在于ST365型血流感染AB中的22个特有蛋白，其生物学过程主要集中于细菌毒力与侵袭力、细菌代谢、DNA合成、DNA损伤及修复、转录翻译、基因转座、以及噬菌体相关蛋白等通路上，见表2。

表2 不同MLST血流感染AB中的特有蛋白及其生物学功能Table 2 Specific protein in AB causing BSI of different types of MLST and their biological functions

3 讨论

AB在大自然环境中广泛分布，尤其在医院环境中广泛定植，是引发医院内获得性感染的重要条件致病菌。研究［11］认为，AB在痰培养中常见，血流感染中少见，但近年随着住院患者医疗操作的逐渐增多，以及对AB的认识及重视程度进一步加深，血流感染中AB检出率越来越高。临床上，患者一旦发生血流感染，病死率极高，预后差。目前，针对AB血流感染的相关研究也越来越多，主要集中于对导致AB血流感染的危险因素分析。

临床工作中发现，长期卧床的ICU患者，在危险因素相同情况下，有些患者仅限于肺部感染，有些患者易发生血流感染，推测影响AB血流感染的相关因素可能还有AB的生物学特性差异，但具体机制尚不清楚。

课题组前期的综述中将AB的致病力主要分为以下几类：（1）对患者的侵袭因素；（2）适应营养物质匮乏等恶劣生存环境的能力；（3）抵抗损伤的能力；（4）外在影响因素［12］。本研究对AB基因数据库进行检索，找到若干株MLST相同，但是分离部位不同的AB菌株。随后，对检索到的相同ST分型AB基因组学数据、蛋白数据进行分析，探讨仅存在于血流感染AB中的特有蛋白。ST92、ST137、ST365三种不同MLST血流感染AB特有蛋白的功能主要集中在细菌毒力与侵袭力、细菌代谢、DNA合成、DNA损伤及修复、转录翻译、基因转座、以及噬菌体相关蛋白等通路上，这些蛋白的功能可归于上述的致病力分类中。

在细菌代谢通路中，存在于ST92型血流感染的AB中的LysM domain-containing protein可正向调控病原菌中铁离子代谢，以促进病原菌的生长［13－14］，存在于ST137、ST365型血流感染的AB中的alcohol dehydrogenase可介导乙醇代谢，并增强AB的致病力［15］；在DNA损伤修复通路中，存在于ST92型血流感染AB中的recombinase RecA、存在于365型血流感染AB中的tyrosine recombinase等重组酶相关蛋白，可以修复损伤的DNA，避免氧化应激对AB产生的致命损伤［16］；存在于ST92型、ST365型血流感染 AB中的IS5／IS1182 family transposase、存在于ST137型血流感染AB中的Tn3 family transposase等基因转座酶，可介导耐药基因在AB中的转移，从而导致治疗抵抗［17］。上述通路中的相关蛋白，均能增强AB在恶劣环境下的生存能力及抵抗损伤的能力。

外膜蛋白A不仅可介导AB黏附并侵袭真核宿主细胞，还可导致宿主细胞死亡并引起免疫刺激，在AB的侵袭过程中扮演重要的角色［18－20］。研究发现，血流感染ST365型AB中外膜蛋白组装因子outer membrane protein assembly factor BamB 能正向促进外膜蛋白的组装与表达，增强AB的侵袭性并介导其入血。同时，存在于ST92型血流感染AB中的转录 起 始 因 子 sigma-70 family RNA polymerase sigma factor、存在于ST365型血流感染AB中的翻译延长因子translation elongation factor Tu及存在于ST137型血流感染AB中的分泌相关蛋白type I secretion protein可能也参与了AB侵袭相关蛋白，如外膜蛋白A的转录、翻译以及分泌过程，进而促进了AB侵袭过程。

噬菌体是一种普遍存在的，能够感染宿主菌并导致其裂解的一类病毒生物体，由于其专一性高、受抗菌药物耐药性影响小，临床上可用于细菌感染性疾病的治疗［21］。然而研究发现，在ST92型、ST365型血流感染AB的特有蛋白中存在一类噬菌体相关蛋白，此类噬菌体相关蛋白如何影响AB的致病力及侵袭力仍需进一步的试验研究。

综上所述，本研究发现在血流感染AB中存在一类特有的细菌致病力相关蛋白、噬菌体相关蛋白，在相同MLST的AB中，由于细菌群体中的个体差异，表达此类特有蛋白的AB，能在临床治疗的情况下存活，且存在高侵袭力的生物学特性，进而介导了血流感染的发生。本研究的创新性在于首次提出探索AB菌株入血的特异危险因子，以期早期预判其入血的可能性，早诊断、早治疗，对改善AB感染患者的预后有重大意义，但本研究也有局限性，由于数据库筛选样本难度大，耗时长，数据库样本量少，且尚未完成实验验证，只是提出初步设想。数据库的前期研究为后期实验验证提供了指导方向，也为广大研究者提供了新的思路，目前课题组正收集多中心的样本及资料，检测血流感染和非血流感染AB相关的特异蛋白，研究此类特殊蛋白，阐明其介导AB入血的具体机制，为临床上AB血流感染的预判、治疗提供帮助。