HIV-1／HBV共感染患者HBV病毒基因组前S区、BCP区和前C区的变异

丁莉莎，姚 涛，江培学，杨志军，贺健梅，郑 军，陈 曦

（1湖南省疾病预防控制中心，湖南 长沙 410005；2长沙市一医院，湖南 长沙 410011；3上海星耀医学科技发展有限公司，上海 200083）

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）的前 C区及C区启动子的变异是近十年来肝炎领域的研究热点。上述两个区域，以及前S区和EnhⅡ区发生突变已被证明与肝纤维化和肝癌的产生密切相关。由于C区，特别是基本核心启动子区在病毒复制中起着重要作用，一旦变异将影响到乙型肝炎e抗原（HBeAg）的表达和宿主的免疫应答，并直接影响慢性肝病患者的病程进展及药物治疗的效果［1－4］。近年来，乙型肝炎病毒合并人类免疫缺陷病毒1 型 （human immunodeficiency virus type 1，HIV-1）共感染人群数量不断上升，防治形势十分严峻，而HIV与肝炎病毒交叉感染会导致感染者免疫水平下降，病毒复制活跃，引发肝脏持续性炎症因子的表达和单核淋巴细胞的活化，加速病程进展。相对于HBV单感染，共感染患者体内的HBV受到HIV-1和宿主免疫系统的共同作用和影响，尚不清楚是否会导致病毒变异和进化的加快。本研究目的为分析共感染人群HBV重点区域的变异，初步探讨此问题。

1 材料与方法

1.1 标本来源 2017年1月—2018年1月长沙市第一医院和郴州市第二人民医院进行HIV和HBV检测的患者，经知情同意后随机挑选40例HIV确证阳性且HBV DNA阳性作为共感染试验组，40例HBV DNA阳性作为单感染对照组，于未开展抗病毒治疗前采血。对乙型肝炎的诊断符合乙型病毒性肝炎诊断标准（WS 299－2008）。

1.2 仪器与试剂

1.2.1 仪器 ABI 7500荧光PCR仪为ABI公司生产，普通PCR仪为珠海黑马医学仪器有限公司生产。

1.2.2 试剂 乙肝五项检测试剂盒购自珠海丽珠医药公司，HBV DNA提取试剂盒、定量试剂盒和扩增试剂盒均由上海星耀医学科技发展有限公司提供。

1.3 全基因组扩增及测序

1.3.1 引物 全基因组扩增引物：HP1 5’→3’CCGGAAAGCTTGAGCTCTTCTTTTTCACCTC TGCCTAATCA；HP2 5’→3’CCGGAAAGCTT-GAGCTCTTCAAAAAGTTGCATGGTGCTGG。

1.3.2 扩增体系及步骤 试剂准备、标本处理和加样按照定量试剂盒说明书和实时荧光定量PCR仪操作规程进行。定量检测反应条件为：50℃，2 min→94℃，5 min→94℃，10 s→60℃，40 s共40个循环。而全基因组扩增体系（50μL）为：DNA Polymerase 0.5μL，Buffer（Mg2＋plus）10μL，dNTP Mixture 4μL ，Primer HP11 1μL，Primer HP21μL，HBV DNA5μL，ddH2O28.5μL。扩增程序为：94℃，1 min→94℃，40 s→60℃，90 s→68℃，3 min共40个循环，每10个循环增加2 min，30个循环以后9 min。

1.3.3 结果检测及测序 采用 ABI 7500 real time Data Analysis分析定量结果。全基因组扩增则每管分别取5μL PCR扩增液，1.5%琼脂糖凝胶100 V 电泳30 min，在3.2 kb处有条带的视为成功扩增目的片段，并送上海生工测序。

1.4 序列分析应用 NCBI BLAST进行基因分型和序列分析，标准参照序列为GQ924603和FJ562219。

1.5 总体变异率比较 以每100个氨基酸／核苷酸中发生氨基酸／核苷酸替换数目的百分比来计算［2］，前S区分析片段总长174个氨基酸，前C区和BCP区分析片段总长158个核苷酸。前S区总突变率＝氨基酸突变数／（测序例数×174）×100%，前C区和BCP区总突变率＝氨基酸突变数／（测序例数×158）×100%。

1.6 统计方法 应用SPSS 21.0软件进行数据分析，正态分布采用t检验比较两组间均数，非正态分布采用秩和检验比较两组间中位数，采用χ2检验对各组间差异性进行分析，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 基本信息 试验组40例患者中，仅21例（52.50%）能成功测得HBV全基因组序列，其中男性17例（80.95%），女性4例（19.05%）；≤40岁者10例（47.62%），＞40岁者11例（52.38%）。而对照组40例患者中，有38例（95.00%）成功测得HBV全基因组序列，检出的基因型和HBV载量值以及性别、感染途径等见表1。湖南省HIV患者感染HBV基因（亚）型以B型为主。试验组与对照组HBV载量值和不同基因型比较，差异有统计学意义（均P＜0.05）。试验组年龄为（40.7±15.0）岁，对照组为（36.3±15.2）岁，两组差异无统计学意义（P＞0.05）。

表1 成功测得HBV全基因组序列的两组患者基本资料比较Table 1 Comparison in basic data of two groups of patients who were successfully detected whole-genome sequence

2.2 序列比对与分析

2.2.1 前S区序列分析比较 前S区序列试验组4份样本中22个氨基酸发生突变，其中，2个前S1区缺失突变，20个前S2区缺失突变。对照组6份样本中42个氨基酸发生突变，其中2个为起始位点突变，16个前S1区缺失突变，24个前S2区缺失突变。实验组和对照组前S区氨基酸总体缺失突变率分别为0.60%、0.64%，差异无统计学意义（χ2＝0.042，P＞0.05）。

2.2.2 前C区和BCP区序列分析分析 前C区和BCP区序列试验组12份样本45个核苷酸发生突变，对照组32份104个核苷酸发生突变，两组前C区和BCP区各个主要突变位点变异发生率比较，差异无统计学意义（均P＞0.05），见表2～3。试验组和对照组前C区和BCP区总体变异发生率分别为1.36%、1.73%，差异无统计学意义（χ2＝1.920，P＞0.05）。

表2 两组患者血清标本HBV前C区突变率比较［份（%）］Table 2 Comparison in mutation rates in pre-C region of HBV in serum specimen of two groups of patients（No.of specimens［%］）

表3 两组患者血清标本HBV基本核心启动子区突变率比较［份（%）］Table 3 Comparison in mutation rates in BCP region of HBV in serum specimen of two groups of patients（No.of specimens［%］）

3 讨论

HBV是一种不完全双链DNA病毒，基因组全长3.2 kb，由四个重叠的开放阅读框（Open Reading Frame，ORF）组成，分别是前S／S（preS／S）区，前C／C（pre core／core）区，X（transcriptional co-activator）区和P（DNA polymerase）区。由于在复制过程中逆转录酶缺乏校正功能，以及免疫逃避等因素的作用，HBV常发生变异。前C区编码HBeAg的前体蛋白，是宿主免疫系统攻击的靶位；而C启动子区，特别是基本核心启动子 （basic core promoter BCP）区在前C mRNA和前基因组RNA（pgRNA）的转录和调控中起着重要的作用，这两个区域的变异直接影响到 HBeAg的表达、病毒复制状态及肝功能［1－2］。前C区的常见变异为G1896A和G1899A，BCP区为T1753V和A1762T＋G1764A双突变，在不同亚型中突变关键位点稍有差异，通常与慢性肝病的病情进展及预后相关，能降低免疫应答并影响干扰素的治疗效果［3－6］，被认为是肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）的高风险因素之一［7］。前S区的缺失突变可导致HBV表面蛋白表达量减少，并且通过消除HLA限制性B细胞和T细胞表位，使得病毒持续存在［5］。前S1／S2区的缺失突变也经常在隐匿性感染（OBI）病例中检测到［8］。此外，HBV S基因中302G→A、345G→A引起的氨基酸变异S50G、Y64C，可能是导致母婴传播HBV宫内感染的原因［9］。而近年来，HBVX区基因突变与原发性肝癌预后的关系也得到证实［10－12］。

由于HIV与HBV具有相同或相似的感染途径，均可经血液、性接触和母婴等途径传播，两类病毒通常发生重叠感染：约有90%～95%的HIV感染者曾经感染过HBV，其中有大约10%～15%发展为慢性乙型肝炎患者［13］，双重感染主要高度流行于注射吸毒人群和献血者中［14－15］。在前期研究中我们发现，大量HIV与HBV感染患者血浆HBV VL值较高而HBeAg呈阴性，且与HBV亚型有一定相关性，提示共感染患者体内存在HBV病毒的高度变异［16］。本实验共收集40份 HIV-1／HBV共感染血清样本，40份HBV单独感染血清样本，但有HBV载量值较高且手工提取HBV DNA定量也为阳性的19份共感染样本无法扩增或者未测序成功，失败率远高于HBV单感染者，原因值得进一步分析，推测可能为引物靶定的位置发生了突变或者个体内突变亚株较多，导致测序紊乱。在成功测序的样本中，共感染组虽然在前S区、前C区和BCP区三个重要区域均有发生缺失突变或者 G1896A、A1762T／G1764A等（已经证明与病情进展和预后有关）关键位点的突变，但突变率与HBV单感染组相比无差异，初步说明短时间内HIV-1的存在对HBV的突变暂无明显影响。但如果长期共存相互作用，HIV-1导致机体免疫功能下降、应答缓慢，HBV复制活跃，是否会发生变化还需更长时间的观察和研究。值得指出的是，部分共感染患者出现一些新的HBV突变位点，如G1854T、A1859T、G1876A等，新的突变位点是否会影响宿主的免疫应答和治疗效果也需进一步分析。