发热伴血小板减少综合征患者核衣壳蛋白特异性IgM水平与病情严重程度的相关性

常海燕，严晓敏，张昭萍，吴卫华，贾 蓓，吴 超

（南京医科大学鼓楼临床医学院，江苏 南京 210008）

发热伴血小板减少综合征（severe fever with thrombocytopenia syndrome，SFTS）是由发热伴血小板减少综合征病毒（SFTS virus，SFTSV）引起的新发传染性疾病［1－3］。在SFTS的发病过程中，活化部分凝血活酶时间（activated partial thromboplastin time，APTT）、血清清蛋白水平、SFTSV-RNA载量、年龄等已被证明是影响SFTS患者预后的独立危险因素［4－6］。SFTSV-RNA 基因主要表达核衣壳蛋白（N蛋白）、Gn和Gc糖蛋白，其中N蛋白是最具免疫原性的抗原，N蛋白特异性抗体在抗病毒过程中通常发挥着关键作用［7－8］。然而，在SFTSV所致的SFTS发病过程中，N蛋白IgM抗体的动态变化及与病情的关系尚不清楚。

本研究回顾性分析了SFTS患者N蛋白特异性IgM（－）组与IgM（＋）组患者的临床症状，并分析了N蛋白特异性IgM抗体水平与实验室检查结果、病情严重程度的相关性，旨在为揭示N蛋白特异性IgM抗体在SFTS发病过程中的作用提供理论依据。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选取2016年1月—2017年11月在某院住院治疗的SFTS患者为研究对象。从病历系统中提取患者的住院信息（包括临床症状），从检验系统中获取其实验室检查结果。纳入标准：符合发热伴血小板减少综合征防治指南（2010版）的标准：（1）急性病程，体温＞38℃；（2）有蜱虫接触史或与SFTS患者有密切接触史；（3）血小板或白细胞计数减少；（4）SFTSV核酸阳性。纳入患者均自愿参与研究并签署知情同意书，且已征得南京鼓楼医院伦理管理委员会审批同意。

1.2 研究方法

1.2.1 病例分组 收集30例SFTS患者的临床症状及实验室结果，根据其在发病2周时N蛋白特异性IgM抗体定性结果将患者分为IgM（＋）组与IgM（－）组；根据患者病情严重程度分为轻症组及重症组；重症患者的定义参考Deng等［1］的研究，任何需要入住重症监护病房并且至少符合以下标准之一的患者均纳入重症患者组：（1）急性肺损伤或急性呼吸窘迫综合征；（2）心力衰竭；（3）急性肾衰竭；（4）脑炎；（5）休克；（6）败血症；（7）弥散性血管内凝血（DIC）；（8）死亡。

1.2.2 试验方法

1.2.2.1 SFTSV-RNA 载量的检测 收集SFTS患者急性发病期（每隔2 d）血清，使用RNA提取试剂盒（Qiagen，Hilden，Germany）从血清样品中提取RNA，并以健康患者的血清作阴性对照，采用实时定量聚合酶链式反应（RT-PCR）试剂盒（BGI，中国深圳）检测SFTSV-RNA载量。

1.2.2.2 N蛋白特异性IgM抗体定性检测 采用ELISA试剂盒（中山生物技术公司，中国广州）进行IgM抗体定性检测。首先取稀释后的血清样本100μL（样品稀释液90μL＋血清10μL）置于酶标孔，37℃孵育40 min，然后用洗涤液洗涤6次；每孔再加入100μL酶结合物，37℃孵育40 min，然后再用洗涤液洗涤6次；每孔分别加入显色液A与显色液B，37℃孵育15 min，在450 nm条件下测量光密度（OD）。如果样品的OD值大于阈值（截止值），相应的孔被认为阳性，否则为阴性。

1.2.2.3 N蛋白特异性IgM抗体滴度的检测 采用传统的ELISA方法对血清进行N蛋白特异性IgM抗体（＋）滴度测定。首先在96孔板中包被N蛋白100μL，4℃冰箱中过夜；然后用0.1%Triton-X的PBS洗涤液200μL洗涤5遍，在4%乳清稀释缓冲液和5%奶粉的混合液200μL中室温封闭1 h，然后再洗涤5遍；加入不同稀释浓度（1∶1 000、1∶2 000、1∶4 000、1∶8 000、1∶16 000、1∶32 000、1∶64 000）的样本血清100μL在室温条件下孵育1 h，再洗涤5遍；每孔中加入稀释的IgM 抗体100μL在室温条件下孵育1 h；每孔中依次加入显色液A、B各50μL，显色3 min，最后加入25μL终止液使反应停止。用全自动多功能酶标仪450 nm处检测OD值，OD值大于正常健康对照两倍的最大稀释倍数被认为是最终IgM抗体滴度。

1.3 统计学分析 应用SPSS 22.0软件对数据进行统计。非正态分布的计量资料以M（P25，P75）表示，两组间比较采用非参数检验；计数资料以率表示，组间比较采用卡方检验；P≤0.05为差异具有统计学意义，所有检验均为双侧检验。

2 结果

2.1 患者基本情况 本研究共纳入患者30例，其中男性10例，女性20例，平均年龄55（48，68）岁，其中高热（＞39℃）患者16例（53.3%），淋巴结大患者8例（26.7%），病情严重患者10例（33.3%），死亡患者5例（16.7%）。

2.2 N蛋白特异性IgM抗体滴度、SFTSV-RNA的动态变化规律 发病第3～6天、第7～9天、第10～13天、第14～20天时N蛋白特异性IgM抗体滴度分别为8 923（0，0）、22 688（0，16 000），43 407（12 000，64 000），31 764（14 000，48 000）；IgM 抗体滴度在发病14 d内逐渐升高，发病14 d后开始下降；发病第10天有15例（50.0%）患者出现IgM抗体，发病第14天有18例（60.0%）患者出现IgM抗体。发病第3～6天、第7～9天、第10～13天、第14～20天时患者的SFTSV-RNA 载 量 分 别 为16 504（0，12 609）、1 814 763（0，54 528）、1 960 334（0，2 094）、415.65（0，82）copies／mL；在发病第13天时15例（50.0%）患者SFTSV-RNA得到清除，在发病第14天时有17例（56.7%）患者SFTSV-RNA得到清除。

2.3 N蛋白特异性IgM（＋）组与IgM（－）组患者临床特点比较 所有患者起病时均有发热，部分患者出现腹泻、头痛、咳嗽、淋巴结大、神经症状等，严重者甚至出现死亡。与N蛋白特异性IgM（＋）组患者相比，IgM（－）组患者病情严重、出现精神症状者较多，且病死率高，两组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 SFTS患者N蛋白特异性IgM（＋）组与IgM（－）组患者的临床特点（例）Table 1 Clinical characteristics of N protein specific IgM（＋）group and IgM（－）group（No.of cases）

2.4 N蛋白特异性IgM抗体滴度与SFTSV-RNA载量相关性 30例SFTS患者按照病情严重程度分为轻症、重症两组；其中轻症组患者20例，重症组患者10例；死亡患者5例，均为重症组患者。两组患者在性别、年龄上比较差异无统计学意义（均P＞0.05）。轻症组患者出院时SFTSV-RNA载量均转为阴性；重症组患者有2例在出院时SFTSV-RNA载量未见转阴，且2例患者均死亡。轻症组患者住院期间N蛋白特异性IgM抗体均为阳性，重症组患者有3例直至出院时N蛋白特异性IgM抗体仍为阴性，其中2例患者死亡，死亡时SFTSV-RNA载量很高。发病第7～9天时轻症组患者N蛋白特异性IgM抗体滴度高于重症组患者，但差异无统计学意义（P＝0.08），SFTSV-RNA 载量低于重症组患者，差异也无统计学意义（P＝0.10）；发病第10～13天时轻症组患者N蛋白特异性IgM抗体滴度高于重症组患者，差异有统计学意义（P＜0.05），SFTSV-RNA载量低于重症组患者，但差异无统计学意义（P＝0.06）。见图1。

图1 轻症组与重症组患者N蛋白特异性IgM抗体滴度及SFTSV-RNA载量的比较Figure 1 Comparison of N protein specific IgM antibody titer and SFTSV-RNA load in mild and severe patients

2.5 重症患者中死亡患者与存活患者IgM抗体和SFTSV-RNA载量特征 重症组患者按预后分为存活组和死亡组。存活组患者与死亡组患者在发病第3～6天、第7～9天、第10～13天、第14～20天时N蛋白特异性IgM抗体滴度分别为48 000 VS 0、15 000 VS 7 200、96 000 VS 64 000、26 666 VS 12 000；存活组患者在发病第3～6天SFTSV-RNA载量为15 771 copies／mL，存活组患者与死亡组患者在发病第7～9天、第10～13天、第14～20天时SFTSV-RNA载量分别为8 093 673 VS 28 358 018、22 823 VS18 905 345、39 VS3 285 copies／mL。与存活组患者相比，死亡组患者N蛋白特异性IgM抗体滴度低于存活组患者，SFTSV-RNA载量高于存活组患者，但差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.6 N蛋白特异性IgM 抗体滴度、SFTSV-RNA载量与实验室结果相关性 采集30例SFTS住院患者发病后不同时间阶段（第0～2天、第3～6天、第7～9天、第10～13天、第14～20天）的血清，检测其SFTSV-RNA载量、N蛋白特异性IgM抗体滴度、凝血功能指标、肝病酶学及心肌酶谱。检测结果显示N蛋白特异性IgM抗体水平与SFTSVRNA载量、凝血酶原时间（PT）、乳酸脱氢酶（LDH）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）均呈负相关（r值分别为－0.495、－0.440、－0.367、－0.280，均P＜0.05）；而与血小板（PLT）呈正相关（r＝0.335，P＝0.002）。SFTSV-RNA 载 量 与 PT、LDH、AST均呈正相关（r值分别为0.606、0.604、0.587，均 P＜0.001）；与 PLT 呈负相 关 （r＝－0.384，P＜0.001）。见图2。

图2 N蛋白特异性IgM抗体滴度、SFTSV-RNA载量与实验室结果相关性Figure 2 Correlation of N protein specific IgM antibody titer，SFTSV-RNA load，and laboratory results

3 讨论

抗体靶向治疗是治疗传染病的一种有效可行的方法，其用于呼吸道合胞病毒和埃博拉病毒感染的治疗均已取得了一定成果。近些年，已经通过诱导中和抗体获取流感病毒疫苗［9］。目前，SFTS尚无特效疗法，主要以支持治疗为主，本病相关的诊治研究相对较少［10］。SFTS患者预后较差，约有12.7%～20.6%患者出现死亡［11－13］，因此，急需更多研究分析SFTS特异性抗体在发病过程中的作用。

近年来，有研究［7－8］发现 SFTSV RNA 基因编码7种蛋白质，其中有3种重要的抗原蛋白，即N蛋白、Gn和Gc糖蛋白。Gn和Gc糖蛋白由M片段编码的前体蛋白切割产生，其主要作用是负责受体结合和膜融合以介导病毒进入宿主细胞，而N蛋白主要集中在诊断及检测SFTS方面。

本研究发现，在急性感染阶段SFTSV特异性体液应答在急性感染期主要是N蛋白特异性抗体应答，而只有少数患者具有Gn或Gc低滴度特异性抗体应答。本研究中近50%患者N蛋白特异性IgM抗体出现中位时间为发病第10天，与其他研究［14］基本一致。在裂谷热病毒（RVFV）或托斯卡纳病毒感染患者中，N蛋白是急性感染期和恢复期期间负责产生IgM 和IgG 的主要抗原［7，15－17］。

本研究还发现N蛋白特异性IgM抗体可能直接或间接地起到减轻SFTS疾病严重程度的作用。首先，研究发现在急性感染阶段缺乏N蛋白特异性IgM抗体的患者SFTSV-RNA载量较高，且病情较为严重。与无N蛋白特异性IgM抗体应答的患者相比，诱导IgM抗体应答的患者疾病进展相对较轻。重要的是，N蛋白特异性IgM抗体应答的水平也与实验室结果改变相关。随着N蛋白特异性IgM应答的出现，SFTSV-RNA得到快速清除，患者凝血功能、肝功能、心肌功能得到恢复，且N蛋白特异性IgM抗体应答较早的患者恢复相对较快。

本研究发现轻症患者在住院期间均出现N蛋白特异性IgM应答，且出现应答时间较早、滴度较高；而重症患者出现N蛋白特异性IgM应答较晚、滴度较低；因此，N蛋白特异性IgM抗体滴度定量检测有助于临床医生评估病毒清除率和患者临床预后。对于无N蛋白特异性IgM抗体应答或具有低水平IgM抗体滴度的SFTS患者需要重视并给予积极有效的治疗策略。

综上所述，本研究发现SFTS患者病情严重程度与N蛋白特异性IgM抗体水平相关，且IgM抗体产生可能是病情得到较快缓解的原因之一。本研究发现高滴度N蛋白特异性IgM抗体的出现有利于改善SFTS疾病的病情，有利于SFTSV的清除，并有助于凝血功能、肝功能、心肌功能的恢复。SFTS患者可以常规进行N蛋白特异性IgM抗体滴度的检测，可能有助于预测SFTS患者的临床预后。此外，N蛋白特异性IgM抗体可能可作为治疗重症SFTS患者的方法，从而降低病死率。本文的局限性主要是本研究为单中心研究，且纳入患者人数少；但N蛋白特异性IgM抗体是否可以预测患者死亡，可以通过扩大样本量进行进一步研究。