CD4+T细胞亚群Th1/Th2和Th17/Treg在卵巢癌中的分布及意义

莫 婧 谭广萍 韦露薇 马艳群 贺红英

(柳州市工人医院妇产科，广西 柳州 545005)

卵巢癌治疗手段包括肿瘤细胞减灭和化疗，但是这些治疗只能在短期中得到缓解，其中有80%左右患者有耐药和复发出现，导致治疗失败〔1～3〕。研究发现，T细胞分泌的细胞因子与肿瘤的发生发展和浸润关联密切，初始CD4+T细胞在不同分化环境下，可以特异分化成辅助性T淋巴细胞(Th)1、Th2、Th17和调节性T淋巴细胞(Treg)4种细胞亚群；其中Th1细胞发挥着细胞免疫的功能；Th2细胞在体液免疫中有重要作用；Treg细胞为免疫抑制细胞亚群，能够抑制免疫效应细胞，与肿瘤免疫逃逸关联密切〔4～7〕。本研究主要探究卵巢癌患者外周血中血CD4+T免疫细胞分化的特点，分析其与卵巢癌发生、发展的关系。

1 材料与方法

1.1样本资料 柳州市工人医院2016年1～6月就诊的30例卵巢癌患者为研究组，年龄30～75(平均53)岁。同期健康体检者20例为对照组，年龄28～70(平均49)岁。样本资料均经受试者同意，并且经过医院伦理委员会批准。

1.2单细胞悬液制备 取受试者20 ml外周血，采用Ficoll-Paque梯度离心分离外周血中的单核细胞。

1.3Th1/Th2和Th17/Treg细胞因子、转录因子检测

1.3.1流式检测 将分离得到的T细胞加入50 ng/ml豆寇酰佛波醇乙酯(PMA)和1 μg/ml离子霉素并孵育1 h。再加2 μmol/L莫能菌素孵育4 h。用ebioscience公司的胞质固定液进行处理，按照说明书操作。通过流式细胞仪检测胞内γ-干扰素(IFN-γ)、白细胞介素(IL)-4、IL-17水平。Treg细胞不用刺激，直接用核固定液进行叉头样转录因子(FOXP)3染色检测。

1.3.2RT-PCR检测 将分离得到的T细胞，用Trizol提取RNA，然后反转录，再用takara公司SYBR Green 进行荧光定量PCR检测。测定T盒子21转录因子(T-bet)、GATA3、维甲酸孤儿核受体家族(ROR)γt、FOXP3表达情况。酶联免疫吸附法(ELISA)检测IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-5、IL-13、IL-17α、IL-17f、IL-21、IL-22、转化生长因子(TGF)-β、IL-10、IL-35表达水平。

1.4仪器与试剂 流式抗体均来自BD公司，ELISA试剂购自e-Bioscience公司。原酶Ⅳ、DNA酶Ⅰ、透明质酸酶及谷氨酰胺均购自Sigma公司。

1.5统计学方法 应用Graph Pad Prism5.0软件进行非配对t检验。

2 结 果

2.1两组Th1/Th2和Th17/Treg 4种CD4+T细胞亚群占比情况比较 与对照组比较，研究组外周血中Th1特异细胞因子IFN-γ表达显著下降(P<0.05)，Th2特异细胞因子IL-4，Th17特异细胞因子IL-17及Treg特异转录因子FOXP3都显著上升，差异均有统计学意义(均P<0.01)。见表1。

表1 两组Th1/Th2和Th17/Treg免疫细胞群的表达情况

2.2两组Th1/Th2和Th17/Treg 4种CD4+T细胞亚群特异转录因子的表达情况比较 与对照组相比，研究组外周血中Th1特异细胞因子T-bet显著下降(P<0.01)。Th2，Th17，Treg特异转录因子GATA3、RORγt，FOXP3均显著上升，差异均有统计学意义(均P<0.05)。见表2。

2.3两组Th1/Th2和Th17/Treg 4种CD4+T细胞亚群相关细胞因子的表达情况 与对照组比较，研究组Th1细胞IFN-γ、IL-2及Th2细胞分泌的IL-4表达水平明显降低(P<0.05)。Th2细胞分泌的细胞因子IL-5、IL-13，Th17细胞分泌的IL-17α，IL-17f，IL-21，IL-22及Treg细胞分泌的TGF-β、IL-10表达水平均显著升高(均P<0.05),IL-35表达水平有上升趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表2 Th1/Th2和Th17/Treg 4种CD4+T细胞亚群转录因子表达情况

表3 Th1/Th2和Th17/Treg 4种CD4+T细胞亚群相关细胞因子的变化

3 讨 论

CD4+T 可分泌大量炎性细胞因子，如IFN-γ 和TGF-β〔4～8〕。不同的CD4+T 细胞亚群其所发挥的免疫作用也不同。Th1细胞主要抵抗胞内微生物，Th2细胞则对胞外病原体，包括寄生虫等发挥免疫作用。Th17细胞抵抗胞外细菌和真菌，而Treg细胞主要是在维持免疫耐受中起重要调控作用。在机体健康状态下，机体本身的免疫系统可以清除异常病变的细胞，从而避免肿瘤的发生。通常认为，肿瘤的发展是某些异常的细胞免疫逃逸而持续发展的结果。这些免疫逃逸的细胞也不是完全逃离免疫系统的监视控制而自由发展。机体精密复杂的免疫系统可以在肿瘤发展过程中形成肿瘤免疫微环境来继续对抗肿瘤给机体造成的危害。细胞免疫在机体抗肿瘤中有重要作用，它没有抗体的参与，但是激活众多其他细胞参与，如激活吞噬细胞，抗原特异性的T淋巴细胞，以及释放多种对抗原起免疫反应的细胞。T细胞介导的细胞免疫，如激活抗原特异的细胞毒T细胞，可以诱导表达外源抗原的细胞凋亡，这些细胞包括病毒感染的细胞，胞内有菌的细胞及表达肿瘤抗原的癌细胞等〔9〕。正常情况下，CD4+T细胞亚群处于平衡状态，使机体处于免疫平衡，维持机体正常肿瘤免疫监控〔10〕。

研究表明，在卵巢癌患者的早期和晚期，分泌抑制性免疫细胞因子包括TGF-β的Treg细胞有显著的上升〔11〕。在小鼠模型体内，肿瘤坏死因子(TNF)-α可以调节肿瘤微环境，其通过促炎因子IL-17来促进卵巢癌的进程〔12〕。实验室发现，相比正常患者外周血单核细胞，在卵巢癌患者体内，表达IL-17的Th17细胞比例明显增多〔13〕。

综上所述，卵巢癌患者外周血中，Th1细胞亚群被抑制，Th2、Th17、Treg 3种亚群比例增加。这些研究为卵巢癌免疫检测与免疫生物治疗提供相关依据，并有可能优化现有的卵巢癌免疫治疗方法。