青蒿素对肾癌细胞株786—0细胞的增殖和Fascin表达的影响

2018-12-12张静查文清陈小鸿蒋莉蒋一雄

中国医学创新 2018年24期

张静查文清陈小鸿蒋莉蒋一雄

【摘要】目的：探讨青蒿素对肾癌细胞株786-0细胞的增殖和Fascin表达的影响。方法：选用786-0肾癌细胞株，分别通过不同浓度的青蒿素作用细胞株，收集不同时间点（0、24、48、72 h）的细胞，运用细胞增殖CCK-8法测定青蒿素对肾癌细胞株786-0细胞的增殖；通过Western Blot检测青蒿素干预后肾癌细胞株786-0细胞Fascin的表达。结果：随着药物浓度的增加，青蒿素可明显抑制肾癌细胞株786-0细胞的增殖（P<0.01），青蒿素可显著降低肾癌细胞株786-0 Fascin蛋白的表达（P<0.05）。

结论：青蒿素通过抑制肾癌细胞增殖和Fascin蛋白的表达，从而抑制肿瘤细胞的恶性增生。

【关键词】肾癌；青蒿素；肾癌细胞株786-0；增殖； Fascin

【Abstract】 Objective：To investigate the effect of Artemisinin on the proliferation and Fascin expression of human renal cell carcinoma cell line 786-0.Method：786-0 cell line were cultured in vitro and treated with different doses Artemisinin.The cells were collected at different time points（0，24，48，72 h）.CCK-8 method was used to detect the cell proliferation，the expression of Fascin in renal cell carcinoma cell line 786-0 cells were analyzed by Western Blot.Result：Different doses artemisinin could significantly inhibit the proliferation of renal cell carcinoma cell line 786-0 with the increase of drug concentration （P<0.01），Artemisinin could obviously reduced the expression of Fascin in renal cell carcinoma cell line 786-0（P<0.05）.Conclusion：Artemisinin might inhibit the proliferation and the expression of Fascin，then inhibit the malignant proliferation of tumor cells.

【Key words】 Renal cell carcinoma； Artemisinin； Human renal cell carcinoma cell line 786-0； Proliferation； Fascin

First-authors address：Nanshan District Peoples Hospital of Shenzhen，Shenzhen 518052，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2018.24.008

腎癌又称肾细胞癌（renal cell carcinoma，RCC）是指起源于肾皮质的具有异质性的肿瘤[1]。肾癌是泌尿生殖系统最常见的恶性肿瘤之一，同时，肾癌起病隐匿，多发现较晚。目前，膀胱癌各种预防和治疗的药物均不理想或毒副作用较大。研究发现Fascin蛋白在多种恶性肿瘤组织中表达显著上调，其异常表达被认为与肿瘤的发生、进展、侵袭及预后等生物学行为相关[2]。青蒿素是一类传统的抗疟药，随着临床试验的深入研究，其抗肿瘤作用备受关注，而在肾癌方面的研究国内外却报道甚少[3]。本实验以人肾癌细胞株786-0作为研究对象，应用CCK-8法和Western Blot等技术观察青蒿素对肾癌细胞株786-0的增殖和Fascin蛋白的表达的影响。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料、仪器与试剂材料：肾癌细胞株786-0（购买于上海中科院细胞库）。仪器和试剂：多功能读板机（Beckman PRADIGM）、蒸汽灭菌锅（上海申安医疗器械厂）、电子天平（Satorius公司）、小型离心机（Eppendorf公司）、倒置相差显微镜（日本索尼公司）、Cell Counting Kit-8（CCK-8试剂盒）（上海碧云天生物技术有限公司）、Facsin Monocional Antibody（美国Millipor公司）、羊抗鼠二抗（Santa Cruz公司）、RPMI1640培养基（Gibco公司）、胰蛋白酶（Hyclon公司）、青蒿素、胎牛血清（Hyclon公司）、磷酸缓冲液（PBS）、96孔细胞培养板、6孔细胞培养板、青霉素/链霉素双抗溶液、二甲亚砜（DMSO）[4]。

1.2 细胞培养将肾癌细胞株786-0细胞于含10%胎牛血清RPMI 1640培养基，5% CO2和37 ℃培养箱中培养。当细胞培养至密度为60%～80%时传代，收集细胞进行后续实验[5]。

1.3 药物处理将青蒿素溶于DMSO，再用细胞完全工作液配制成200、100、50、25 mg/L四个不同浓度的工作液。

1.4 CCK8法测定细胞增殖在96孔板中取24个孔（取板中间孔，周围一圈弃置，加培养基防蒸发），做好相应标记，取4个孔加培养基作为空白组，其余20孔中均加入100μL的细胞悬液（细胞计数2×103个/孔）。将培养板在37 ℃，5% CO2培养箱培养24 h，将孔中培养基吸出，向每孔加入100 μL待测药物，各浓度均设4个附孔。培养板继续置于培养箱孵育24 h，向每孔加入10 μL CCK-8溶液。将培养板在培养箱内孵育1～4 h，用酶标仪在450 nm处测定其吸光度。记录结果，以青蒿素浓度为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。肾癌细胞株786-0细胞抑制率（%）=（对照组吸光度-青蒿素药物组吸光度值）/对照组吸光度×100%[6-8]。

1.5 Western Blot检测Fascin的表达 RIPA裂解液提取细胞总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，10%的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳后，半干转印到PVDF膜，5%的脱脂奶粉中封闭90 min，加一抗（Fascin 1.25∶1 000，β-actin 1∶1 000）4 ℃过夜；洗膜后加入1∶1 000的二抗稀释液室温下孵育1 h。ECL显色曝光，凝胶成像系统进行扫描分析；实验重复3次[9]。

1.6 统计学处理采用SPSS 19.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（x±s）表示，比较采用t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CCK-8法检测青蒿素对肾癌细胞株786-0细胞的增殖不同浓度（0、25、50、100、200 mg/L）的青蒿素对肾癌细胞株786-0细胞作用48 h后，在450 nm处其吸光度分别为（2.17±0.04）、（1.62±0.13）、（1.21±0.09）、（0.83±0.14）、（0.61±0.12）。依据抑制率（%）=（对照组吸光度-药物组吸光度值）/对照组吸光度×100%。不同浓度（0、25、50、100、200 mg/L）的青蒿素对肾癌细胞株786-0细胞作用48 h后，其抑制率分别为0、（27.0±2.2）、（48.0±3.6）、（64.0±4.8）、（73.0±2.1）%，见图1，各浓度间进行两两比较，差异均有统计学意义（P<0.05）。

2.2 Western Blot检测不同浓度青蒿素对肾癌细胞株786-0 Fascin蛋白的表达以GAPDH作为蛋白定量内参，运用Image J分析Fascin蛋白表达的灰度值，不同浓度的青蒿素（0、25、50、100、200 mg/L）分别干预肾癌细胞株786-0细胞作用48 h后，Fascin蛋白的灰度值分别为（158.0±10.2）、（120.0±7.5）、（82.0±11.4）、（41.0±4.8）、（33.0±6.2），与0 mg/L青蒿素比较，青蒿素药物组干预肾癌细胞株786-0细胞后的Fascin蛋白表达均降低，差异均有统计学意义（P<0.05），见图2。

3 讨论

肾癌患者往往对放疗和化疗耐受，其治疗效果不理想，青蒿素及其衍生物是一类高效、速效、低毒的抗疟药物，近年来的研究发现，青蒿素及其衍生物除了具有抗疟作用外，对多种肿瘤细胞具有选择性抑制和/或杀伤作用[10-11]。本研究选择肾癌细胞株786-0为研究对象，體外观察青蒿素对肾癌细胞株786-0的增殖和Fascin蛋白表达的影响。

肿瘤的发生、发展与细胞的增殖和分化有关，肿瘤药物可以通过多种方式抑制肿瘤细胞的生长，如调控周期、凋亡和坏死等。研究表明，青蒿素对肿瘤的杀伤主要是通过调控细胞周期和诱导细胞凋亡途径实现[12-14]。笔者通过CCK-8实验发现，不同浓度（0、25、50、100、200 mg/L）的青蒿素对肾癌细胞株786-0细胞作用48 h后，明显能够抑制肾癌细胞株786-0的生长，并随着浓度的增加，其抑制作用呈逐渐增强趋势，即说明青蒿素对肾癌细胞株786-0体外抑制作用明显，可以明显抑制肾癌细胞株786-0的增殖，从而达到肿瘤抑制的目的。研究报道肿瘤的发生是细胞过度增殖的结果，无论体外或体内的实验都已证明，青蒿素对肿瘤有明显的抑制作用[15]。国外有学者研究发现对青蒿素对人慢性粒细胞白血病红白血病变细胞株的生长抑制作用，从而进一步证实了青蒿素通过抑制肿瘤细胞过度增殖作用途径实现抗肿瘤的作用[16-17]。

Fascin是一种分子量为55 kD的骨架蛋白，主要是和肌动蛋白结合，早期研究发现Fascin蛋白在一些恶性肿瘤中表达上调，并与肿瘤的侵袭和转移高度相关，骆曼等[18]报道Fascin蛋白在肾细胞癌中表达上调并和肿瘤的进展相关，并证实Fascin可以作为肾癌一个分子标志物，用于恶性肿瘤的诊断和鉴别，同时胡娜等[19]发现，沉默肾癌细胞中的Fascin表达后，细胞的迁移侵袭能力明显减弱。而本研究发现，Fascin蛋白也在肾癌细胞株786-0中高表达，应用不同浓度（0、25、50、100、200 mg/L）的青蒿素对肾癌细胞株786-0细胞作用48 h后，青蒿素能够明显抑制Fascin蛋白在肾癌细胞株786-0的表达，即说明青蒿素可以通过抑制Fascin蛋白在肾癌细胞中的表达，从而抑制肾癌的发生发展[20]。

综上所述，蒿素作为一种毒副作用较少的中药成分，一定程度上能抑制膀胱癌RT4细胞的增殖，并促进其死亡，有可能成为一种新型辅助化疗药物。青蒿素在体外能够明显抑制肾癌细胞株786-0的增殖和Fascin蛋白的表达，至于青蒿素的确切作用机制和在体内抗肾癌作用尚需进一步探讨。

参考文献

[1] Fukushima H，Nakanishi Y，Kataoka M，et al.Prognostic Significance of Sarcopenia in Patients with Metastatic Renal Cell Carcinoma[J].J Urol，2016，195（1）：26-32.

[2] Stewart C J，Crook M L.Fascin expression in undifferentiated and dedifferentiated endometrial carcinoma[J].Hum Pathol，2015，46（10）：1514-1520.

[3] Slezakova S，Ruda-Kucerova J.Anticancer Activity of Artemisinin and its Derivatives[J].Anticancer Res，2017，37（11）：5995-6003.

[4] Das A K.Anticancer Effect of AntiMalarial Artemisinin Compounds[J].Ann Med Health Sci Res，2015，5（2）：93-102.

[5] Jia J，Qin Y，Zhang L，et al.Artemisinin inhibits gallbladder cancer cell lines through triggering cell cycle arrest and apoptosis[J].Mol Med Report，2016，13（5）：4461-4468.

[6] Liu Y，Wang W，Xu J.Dihydroartemisinin inhibits tumor growth of human osteosarcoma cells by suppressing Wnt/β-catenin signaling[J].Oncol Rep，2013，30（4）：1723-1730.

[7] Hargraves K G，He L，Firestone G L.Phytochemical regulation of the tumor suppressive microRNA，miR-34a，by p53-dependent and independent responses in human breast cancer cells[J].Mol Carcinog，2016，55（5）：486-498.

[8]張祥宇，张乃文，刘东方，等.fascin及Galectin-3在肾细胞癌中的表达及意义[J].临床泌尿外科杂志，2013，28（5）：328-331.

[9] Rink M，Chun F K，Robinson B，et al.Tissue-based molecular markers for renal cell carcinoma[J].Minerva Urol Nefrol，2011，63（4）：293-308.

[10]来卫东，戴尊收，赵爱国，等.miRNA-30a-5p过表达对肾癌细胞株786-0增殖、凋亡的影响[J].山东医药，2017，57（38）：23-26.

[11]董建设，赵俊峰，陈瑞廷，等.中药千金子对肾癌细胞株786-0增殖作用的影响及对G250蛋白影响研究[J].临床研究，2017，25（5）：3-6.

[12]陈俊明，吴登爽，王志向，等.RNA干扰p38基因对肾癌786-0细胞生物学特性的影响及对舒尼替尼的增敏作用[J].第二军医大学学报，2016，37（7）：799-804.

[13]黄桥华，郭晓静，刘小云.叶下珠抑制人肾癌786-0细胞增殖作用的研究[J].中国中医药现代远程教育，2017，15（11）：145-146.

[14]吴瑞环，张振凌，王瑞生，等.千金子炮制前后对人肾癌786-0细胞增殖及特异抗原G250基因表达的影响[J].中华中医药杂志，2016（1）：306-309.

[15]曹赫然，殷凤朝，赵淑欣，等.骨桥蛋白对肾癌786-0细胞株增殖能力的研究[J].世界中医药，2016，11（b06）：1626-1627.

[16]倪建鑫，武国军.siRNA下调Ets2对肾癌786-0细胞增殖的影响[J].现代肿瘤医学，2017，25（13）：2027-2030.

[17]黄巧丽.来氟米特对肾癌细胞增殖和凋亡的影响[D].金华：浙江师范大学，2016.

[18]骆曼，李灵毅.Fascin-1对恶性黑色素瘤细胞增殖和凋亡的影响及其作用机制[J].山东医药，2017，57（28）：43-45.

[19]胡娜，李辉然，刘琳琳，等.肾癌细胞株786-0侧群细胞生物学特性与XIAP mRNA表达的研究[J].中华肿瘤防治杂志，2016，23（22）：1483-1487.