基于美白功效研究苓术芍丹汤的提取工艺

王红松，魏大厦，戴晓婷，王 婷，陈卫东

(安徽中医药大学，安徽 合肥 230012)

中医理论认为皮肤的色斑主要是由于肝郁血瘀、脾虚湿蕴、肾精亏虚、冲任失调等原因引起的，可通过服用具有疏肝解郁、健脾化湿、滋补肾精、调理冲任、养血活血等作用的中草药来减少色素沉着。苓术芍丹汤为笔者多年跟师学习并结合自身临床经验总结所得，主要由茯苓、白术、白芍、丹参、红景天、当归、甘草7味药物组成，具有健脾化湿、益气养血、活血化瘀等作用，从而发挥祛斑美白的功效。现代医学认为，黑色素的含量和分布影响皮肤的颜色[1]，黑色素形成的关键酶为酪氨酸酶，故抑制酪氨酸酶的活性可以减少黑色素形成，从而达到美白效果。此外，黑色素的形成与细胞内外的氧化反应有关，因此抗氧化中药也具有美白功能[2-3]。酪氨酸酶抑制率试验主要优点为操作简便、高效，可成为初步筛选美白类药物的方法。1，1-二苯基-2-苦基肼(1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)自由基抑制率试验具有灵敏度高、操作简便等优点，因此常用于中药材抗氧化活性的测定[4]。尤卓莹和黄永红等[5-6]均采用生化酶学法和DPPH分析法综合评价四物汤和当归补血汤的美白功效。故本研究以苓术芍丹汤作为研究对象，对酪氨酸酶的抑制率采用生化酶学法测定，抗氧化活性采用DPPH分析法检测，以酪氨酸酶抑制率和DPPH自由基清除率的综合评分为美白功效的评价指标，采用正交设计法优选苓术芍丹汤的最佳提取工艺。

1 仪器与试药

1.1 仪器 R-100N型旋转蒸发仪：郑州市长城科工贸有限公司；PL601-S型千分之一电子天平：梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；AB135-S型1/10万电子天平：德国Mettler Toledo公司；XW-80A微型旋涡混合仪：上海沪西仪器有限公司；SPECORD-S600紫外分光光度计：德国耶拿分析仪器股份公司。

1.2 试药 茯苓(批号 17080101)、白术(批号 1701171)、白芍(批号 1710191)、丹参(批号 170408)、红景天(批号 1712082)、当归(批号 1706031)、甘草(批号 1709016)：均购自安徽普仁中药饮品有限公司；酪氨酸酶：Sigma公司；L-多巴胺：上海伊卡生物技术有限公司；混合磷酸盐：上海虹北试剂有限公司；DPPH：上海源叶生物科技有限公司；其他试剂均为分析纯级别。

2 方法与结果

2.1 溶液的配制

2.1.1 DPPH自由基溶液的配制 精确称取一定量的DPPH，加入一定量的无水乙醇制备成浓度为0.01 mg/mL的溶液，避光保存在4 ℃环境中。

2.1.2 磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffer saline，PBS)的配制 取一袋混合磷酸盐倒入容量瓶中，根据说明书要求加入250 mL水，配制PBS溶液(pH=6.8)，放置常温保存，备用。

2.1.3 酪氨酸酶溶液的配制 精确称取酪氨酸酶，用已配制好的PBS溶液配制成约200 U/mg的酪氨酸酶溶液，-20 ℃冷冻保存，用之前放置于4 ℃下解冻。

2.1.4 L-多巴胺溶液的配制 精密称取一定量的L-多巴胺，先用少量的0.1 mol/L盐酸完全溶解，然后再加已配制好的适量PBS溶液配制L-多巴胺溶液，使其终浓度为1.5 mg/mL，避光冷藏保存在4 ℃条件下。

2.2 苓术芍丹汤美白功效的评价

表1 用于检测酪氨酸酶抑制率的反应液组成

2.3 正交试验 由单因素考察结果设计正交试验，以料液比(A)、提取时间(B)、提取温度(C)和提取次数(D)为试验因素，按L9(34)正交表进行平行操作试验。因素、水平表见表3。

表2 用于测定DPPH自由基清除率的反应液组成

表3 正交试验因素水平表

称取茯苓、白术、白芍各15 g，丹参、当归、红景天各10 g，甘草5 g，以70%乙醇为提取溶剂，按照正交试验因素水平表制备苓术芍丹汤的供试液，按“2.2”项下的方法进行美白功效的评价，并对结果进行方差分析，结果见表4和表5。

表4 正交试验分析结果

注：美白度=酪氨酸酶抑制率×0.5+DPPH自由基清除率×0.5

表5 方差分析结果

注：F0.05(2，2)=19

由表4可知，基于单因素考察和正交试验结果，各因素对提取效果影响的顺序依次为：提取温度、提取次数、料液比、提取时间，表5显示提取温度和提取次数这两个因素对提取工艺的影响具有统计学意义。故综合直观分析结果和方差分析结果确定苓术芍丹汤的最佳提取条件为A3B3C2D1，即料液比为1∶7 g/mL，提取时间为1.5 h，提取温度为80 ℃，提取1次。

2.4 验证试验 为了验证结果的准确性和真实性，保证优选得到的为最佳、合理的提取工艺。采用A3B3C2D2组合作为提取工艺，制备苓术芍丹汤的供试液，平行制备3份，按“2.2”项下的方法进行美白功效的评价，结果酪氨酸酶抑制率为97.31%(n=3，RSD=1.27%)，DPPH自由基清除率为92.92%(n=3，RSD=1.88%)，美白功效为95.11%(n=3，RSD=0.99%)。结果表明优化筛选后的提取方法合理、稳定、可行、准确，且具有可操作性和重现性。

3 讨论

本研究以酪氨酸酶抑制率和DPPH自由基清除率为美白功效的评价指标优选苓术芍丹汤的最佳提取工艺。在单因素考察试验中，对料液比、提取时间、提取温度、提取次数、提取溶剂进行考察，其中在对不同的溶剂(水、30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、90%乙醇)考察时发现，当乙醇浓度不高于70%时，美白度与乙醇浓度呈正相关关系，当乙醇浓度达到70%时，美白度达到饱和状态，所以在试验中选择70%乙醇作为提取溶剂。通过正交试验结果发现，以7倍的70%乙醇在80 ℃下对苓术芍丹汤进行加热回流提取1次，每次1.5 h时，美白功效达到最佳。该工艺合理、稳定，为苓术芍丹汤的临床应用提供实验数据的支撑，也为其进一步研究提供依据。