羊栖菜褐藻糖胶的提取工艺优化及理化性质分析

刘 剑，杨亚彪，程 阳，王 妍，佟海滨，吴明江，张 旭

(温州大学生命与环境科学学院，浙江温州 325035)

羊栖菜（Sargassum fusiforme）属于褐藻门、褐藻纲、墨角藻目、马尾藻科、马尾藻属的一种海洋孢子植物，别名玉草、海草、六角菜、海大麦、鹿角尖等，从辽东半岛到雷州半岛均有分布，其中以浙江和福建沿海居多[1].羊栖菜是一种营养丰富的药食两用海藻，其干燥藻体全株入药，称为海藻.《神农本草经》中记载羊栖菜味咸、性寒，归肝、胃、肾经，具有软坚散结、消痰、清凉解毒、破血祛淤以及利水消肿等功效，用于缓解与治疗瘿瘤、瘰疬、睾丸肿痛、痰饮水肿等病症.现代药理研究表明多糖是羊栖菜的主要活性物质，羊栖菜多糖的主要成分为褐藻糖胶（Fucoidan）、褐藻胶（Alginic acid）和褐藻淀粉（Laminaran）.大量研究证实羊栖菜多糖对治疗肿瘤、心血管疾病、降低血糖、调节血压、减轻氧化应激损伤和延缓衰老等方面都有显著效果[2-6]，而这些生物活性主要与褐藻糖胶密切相关.同时，前期的研究发现羊栖菜褐藻糖胶可以活化Nrf2信号通路，上调抗氧化酶系的表达，缓解机体衰老进程[7].羊栖菜褐藻糖胶毒副作用小、安全性高，在保健品或药物的开发利用方面具有十分重要的意义.

以往的研究多以多糖得率为指标，优化多糖提取工艺[8-10]，然而，提取得率最高的工艺条件未必会制备出生物活性最佳的提取物.因此，有学者在经典提取工艺评价指标的基础上，加入提取物活性的评价指标来综合评价提取工艺的优劣，并通过正交试验确定其最佳提取工艺[11-12].有学者报道了羊栖菜褐藻糖胶的提取工艺优化[13-14]，但是有关结合清除自由基能力优化羊栖菜褐藻糖胶的提取工艺尚未见报道.因此，本研究旨在优选出得率较高并且抗氧化活性较好的羊栖菜褐藻糖胶提取工艺，为其深度开发利用提供理论依据.

1 实验部分

1.1 材料仪器

羊栖菜：由浙江省温州市洞头区羊栖菜养殖地提供.

DPPH（1,1-二苯基-2-三硝基苯肼），MACKLIN；三氟乙酸，ALADDIN；PMP，ACROS ORGANICS；D-葡萄糖醛酸，Sigma；右旋糖苷标样，D-甘露糖，D-木糖，中国药品生物制品鉴定所；L-鼠李糖，D-半乳糖醛酸，国药集团化学试剂有限公司；D-葡萄糖，TCI；D-半乳糖，L-阿拉伯糖，L-岩藻糖等.

1525高效液相色谱仪，Waters科技有限公司；ODS-2HYPERSIL色谱柱，Thermo Scienfic；TSK gel G-3000PWXL-CP色谱柱，日本TOSOH公司；ICS-1000型离子色谱仪，戴安公司.

1.2 实验方法

1.2.1 羊栖菜褐藻糖胶的提取工艺

将羊栖菜粉碎回流脱脂，得脱脂藻粉.按照酸提（2 mol / L）[15]、水提、氯化钙提（1%）[16-17]方法，以不同的液料比、提取时间、提取温度进行提取，得到羊栖菜总多糖提取液，加入4 mol / L氯化钙沉淀褐藻胶，经离心、浓缩、透析后，向上清液中加入 4倍体积无水乙醇，4℃过夜后离心收集沉淀，经真空冷冻干燥后得到羊栖菜褐藻糖胶（提取流程见图1）.精确称量后计算羊栖菜褐藻糖胶的得率.

图1 羊栖菜褐藻糖胶提取工艺流程图Fig 1 The Extraction Process Flow Diagram for Sargassum Fusiforme Fucoidan

1.2.2 羊栖菜褐藻糖胶清除DPPH自由基活性

参考文献[18]，每支试管中加入0.1 mmol / L DPPH溶液1 mL，待测样品溶液1 mL（浓度分别为：0、50、100、200、400、800、1 600 μg / mL），混匀后避光静置30 min，在517 nm处测定吸光值A样品.空白组为2 mL无水乙醇代替DPPH乙醇溶液，测其吸光值A空白.对照组为1 mL蒸馏水代替样品溶液，测其吸光值A对照.根据以下公式计算样品的DPPH自由基清除率.

1.2.3 单糖组成分析

参考文献[19]，应用PMP衍生化——高效液相色谱法分析样品的单糖组成.

1.2.4 分子量测定

参考文献[20]，应用高效凝胶渗透色谱法测定样品相对分子量.

1.2.5 红外光谱分析

取少量干燥样品，加入适量KBr粉末，并在红外干燥箱中充分研磨，压片，在500 – 4 000 cm-1范围内进行红外扫描.

1.2.6 总糖、糖醛酸和蛋白含量测定

利用苯酚硫酸法[21]测定总糖含量，间羟基联苯法[22]测定糖醛酸含量，考马斯亮蓝法[23]测定蛋白含量.

1.2.7 硫酸根含量测定

用离子色谱法测定硫酸根含量.称取干燥的羊栖菜褐藻糖胶样品3 mg，加3 mL盐酸（1 mol / L）100℃水解3 h，氢氧化钠中和后，选用Shodex IC-52 4E柱（4.0 mm × 250 mm），以4.5 mmol / L碳酸钠和0.8 mmol / L碳酸氢钠为流动相，流速为0.8 mL / min.

2 结果与讨论

2.1 正交试验优化具有DPPH清除能力的羊栖菜褐藻糖胶的提取工艺

多糖的提取率主要是与提取介质、料液比、提取温度、提取时间等因素相关[24-25].因此，设定正交实验的因素水平，见表1.

表1 正交试验因素水平表Table 1 The Orthogonal Factor Level Table

按照L9(34)正交设计表的条件进行试验，分别测定羊栖菜褐藻糖胶的得率和自由基清除率.综合指标为各评价指标乘以权重系数相加所得（综合指标 = 0.5 × 多糖得率 + 0.5 × 自由基清除率），结果见表2.由表2正交试验结果可知，极差的结果为RA＞ RD＞ RC＞ RB，表明影响羊栖菜褐藻糖胶提取率的因素依次为 A ＞ D ＞ C＞ B.方差分析表明，4个因素中，A具有显著影响（F =19.668，P＜0.05），其它因素的影响均不显著，由此预测优化后的最佳提取工艺为A1B1C3D1，即提取介质为蒸馏水，液料比为20∶1，提取温度为85℃，提取时间为1 h.

2.2 DPPH自由基的清除作用结果分析

正交试验获得的羊栖菜褐藻糖胶对DPPH自由基的清除作用见图2.从图2可看出，不同提取介质制备的羊栖菜褐藻糖胶对DPPH自由基均有不同程度的清除作用，清除率随着多糖浓度的增大而上升.水提羊栖菜褐藻糖胶的DPPH自由基清除能力较强，清除率达52.5% – 82.6%，而由盐酸提取到的样品清除率只有26.5% – 33.5%，提取介质为氯化钙所得样品的清除率在60.9% –66.7%.以上表明提取介质对褐藻糖胶的DPPH自由基清除能力影响较大，以盐酸为介质的提取过程中，褐藻糖胶中发挥抗氧化的活性基团和结构可能被破坏，导致酸提样品对DPPH自由基的清除能力最弱.

表2 正交试验设计表及结果Table 2 The Orthogonal Test Design Table

2.3 验证试验

为验证该工艺的优劣和稳定性，按优化工艺条件进行了3次重复试验，测定提取物中各指标性数据，并计算综合评分.羊栖菜褐藻糖胶的平均得率为7.37%，DPPH的平均清除率为84.13%，其相对标准偏差为2.31%，实验结果稳定，表明优化的羊栖菜褐藻糖胶提取工艺稳定可行，结果见表4.

表3 工艺验证试验结果Table 3 The Verification Results of Process Certification

2.4 羊栖菜褐藻糖胶的理化性质测定

经过上述实验的验证后，通过优化后的工艺条件提取获得了具有较好自由基清除能力的羊栖菜褐藻糖胶，并对其基本理化性质进行了测定分析.

2.4.1 分子量测定

羊栖菜褐藻糖胶的相对分子质量通过高效凝胶排阻色谱法（HPGPC）进行测定.首先，利用不同分子量的葡聚糖标准品在HPGPC中的保留时间绘制标准曲线，求得回归方程如图3所示.利用标准曲线计算得到羊栖菜褐藻糖胶的分子量分布范围在39.5 – 53.0 kDa和53.0 – 110.2 kDa，表明羊栖菜褐藻糖胶分子量分布较广.

2.4.2 红外光谱

如图4，样品在3 439 cm-1、2 926 cm-1和1 047 cm-1处有多糖的特征吸收峰，分别是O-H伸缩振动峰、C-H振动吸收峰、羧基的C-O伸缩振动峰.在1 509 cm-1附近有羰基非对称伸缩振动、酰胺基N-H变角振动，表明含有糖醛酸，也可能存在与蛋白质结合的褐藻糖胶；810 – 850 cm-1吸收峰是C-O-S伸缩振动，它的位置与硫酸根在糖残基上的连接位置有关[26].羊栖菜褐藻糖胶在821 cm-1处有中等强度吸收峰，表明它们的硫酸根连接于糖残基的C2或C3位；在1 250 cm-1处有较强的S=O对称伸缩振动，表明羊栖菜褐藻糖胶中硫酸根含量较高.

图2 不同提取条件下制备的羊栖菜褐藻糖胶对DPPH的清除作用Fig 2 The Scavenging Action of Sargassum Fusiforme Fucoidan to DPPH under the Different Exaction Conditions

2.4.3 基本理化性质测定

羊栖菜褐藻糖胶的基本理化性质见表4.由表4可知，羊栖菜褐藻糖胶的碳水化合物含量为80.3%，含有8.5%的糖醛酸，蛋白质含量为1.3%，硫酸根含量为17.1%.已有大量文献报道硫酸根基团与褐藻糖胶的许多重要生物活性密切相关.

2.4.4 单糖组成

采用PMP柱前衍生HPLC法对羊栖菜褐藻糖胶的单糖组成进行分析，通过与9种单糖标准品色谱图的出峰时间相比较（如图5所示），确定各组分的单糖组成[19]，并结合样品中各单糖的峰面积，计算得出各单糖的摩尔比例.如表5所示，羊栖菜多糖的单糖组成相对复杂，由7种单糖构成，其中Fuc和Gal含量最多，分别为68.5%和17.5%，含Glc为5.4%，Man和Rha的含量都在3%左右，Xyl含量最低只有2.3%.

图3 羊栖菜褐藻糖胶的高效凝胶排阻色谱图Fig 3 The High Performance Size Exclusion Chromatography Diagram of Sargassum Fusiforme Fucoidan

图4 羊栖菜褐藻糖胶的红外光谱图Fig 4 The Jnfra-red Spectrogram of Sargassum Fusiforme Fucoidan

图5 PMP-柱前衍生液相色谱图Fig 5 The Liquid Chromatogram of PMP Pre-column Derivatization

表4 羊栖菜褐藻糖胶的基本理化性质Table 4 The Basic Physicochemical Properties of Sargassum Fusiforme Fucoidan

表5 单糖组成分析Table 5 The Monosaccharide Composition Analysis

3 结 论

正交试验结果表明提取介质对于羊栖菜褐藻糖胶的提取有显著影响，综合分析优化得到提取羊栖菜褐藻糖胶的最优方案为：20倍量蒸馏水提取，85℃提取3次，每次1 h，多糖的平均得率可达到7.37%，DPPH的平均清除率可达到84.13%.优化后的工艺稳定可靠，产物得率高且抗氧化活性好，可作为工业化大生产提取羊栖菜褐藻糖胶的工艺条件.本实验优选提取工艺时，采用多指标综合加权评分法，避免了单一评价的片面性，使分析更加全面，从而使优选出来的提取条件更加科学合理.

褐藻糖胶等生物大分子的活性往往由它的结构决定，故分子量的大小、单糖组成、官能团等理化性质的不同都能影响褐藻糖胶的生物活性.Kasai等[27]研究发现，低分子量、硫酸基团取代度较高的褐藻糖胶生物活性较好.羊栖菜褐藻糖胶的理化性质和抗氧化活性因其提取介质的不同而存在较大差异[16]，本实验用蒸馏水提取的羊栖菜褐藻糖胶的糖含量、糖醛酸及硫酸根含量都相对较高，蛋白质含量相对较低，对DPPH自由基的清除能力较强.羊栖菜多糖独特的抗氧化和抗衰老作用，与其高效清除体内自由基的能力密切相关[1-7].因而，优化并建立具有良好抗氧化活性的羊栖菜褐藻糖胶的提取工艺，将成为充分利用并挖掘我国海洋药物资源的有效途径.