褐藻酸裂解酶的研究进展

孙艳宾，陈洪基，姜国良

（山东药品食品职业学院，山东威海264210）

褐藻酸裂解酶的研究进展

孙艳宾，陈洪基，姜国良

（山东药品食品职业学院，山东威海264210）

随着海洋药物和海洋保健制品的蓬勃发展，海洋多糖及其降解产物的研究也引起了广泛的重视。利用褐藻酸裂解酶对褐藻酸进行降解，获得具有多种新型生物活性的海藻寡糖，已成为近几年研究的热点。该文介绍了褐藻酸裂解酶的来源、分类、结构、生物学功能及酶解机理，并对褐藻酸裂解酶的应用前景进行了讨论。

褐藻酸；褐藻酸裂解酶；海藻寡糖

褐藻酸是由褐藻植物和某些细菌产生的直链多糖[1]，β-D-甘露糖醛酸（M）和其C5差向异构体α-L-古罗糖醛酸（G）通过α-1,4-糖苷键结合形成3种褐藻酸分子：聚β-D-甘露糖醛酸（ployman-nuronicacid，PolyM）、聚α-L-古罗糖醛酸（polygulonichya-luronicacid，PolyG）和杂聚物（ployman nuronicacid and gulonichy aluronic acid，PolyMG）[2]。褐藻酸作为褐藻植物细胞壁的主要结构成分，在马尾藻中的含量尤为丰富，另外某些假单胞菌也会分泌乙酰化的褐藻酸。生产褐藻酸的原料以泡叶藻、巨藻和人工养殖的海带为主，也有少量的马尾藻。由于褐藻酸具有金属螯合和高粘滞性能，该多糖常作为稳定剂、增稠剂和乳化剂广泛应用于食品、化工和制药等领域[3]。褐藻酸也具有生物活性，如PolyM能诱导单核细胞分泌细胞因子[4]，相反PolyG能抑制白细胞分泌白介素和肿瘤坏死因子（tumornecrosisfactor，TNF）[5]，在提高机体免疫力和治疗免疫疾病等方面有良好的用途。

海洋天然产物的开发正方兴未艾，褐藻酸裂解产物——海藻寡糖是目前研究最受关注的海洋活性物质之一，海藻寡糖不仅有褐藻酸大分子的某些功能性质，而且具有很多褐藻酸所不具备的独特的生理活性和功能特性，如抗肿瘤[6]、诱导细胞因子[7]、抑菌活性[8]、降血压[9]、抗凝血[10]、抗氧化[11]、神经保护、促进植物生长[12]等。褐藻酸的降解方法主要有化学降解法（酸碱处理、氧化降解）和酶降解法。褐藻酸酶降解法与化学降解法相比，具有反应条件温和，降解过程及产物分子质量易控制，海藻寡糖活性高并且对环境无污染的特点，其研究具有深远的意义和应用价值。

1 褐藻酸裂解酶研究现状

1.1 褐藻酸裂解酶来源

1931年，有学者从鲍鱼内脏中分离出了褐藻酸裂解酶，研究人员陆续从海洋动物、海洋藻类和微生物中发现了褐藻酸裂解酶。其中产褐藻酸裂解酶的微生物种类复杂，分布广泛，是目前研究最多的一类。海洋细菌和土壤细菌是最主要的来源（如黄杆菌、假单胞菌、芽孢杆菌、肠杆菌、克雷伯氏菌、弧菌等）。少数的真菌和病毒也存在褐藻酸裂解酶基因，SINGHRP等[13]从网地藻附近的一株米曲霉（Aspergillus oryzae）中纯化出了褐藻酸裂解酶，该酶能专一性识别PolyM和PolyG之间的β-1,4糖苷键，Co2+和Na+能明显提高酶的活性。DAVIDSON I W等[14]发现固氮菌（Azotobacter vinelandii）的噬菌体诱导产生PolyM裂解酶，对固氮菌褐藻酸被膜有很强的穿透作用。不同来源褐藻酸裂解菌的褐藻酸裂解酶酶学性质见表1。

表1 不同来源褐藻酸裂解菌的褐藻酸裂解酶酶学性质Table 1 Enzymatic properties of alginate lyase from different sources of alginate lysis bacteria

1.2 褐藻酸裂解酶分类

按分子质量的大小，褐藻酸裂解酶主要分为三大类：20～35ku[26-28]、40ku、60ku[29]。分子质量40ku的酶类对PolyM具有特异性，分子质量20～35ku的酶类有不同的底物特异性。

按照底物特异性，褐藻酸裂解酶被分为：专一性裂解PolyM的PolyM裂解酶，如来自铜绿假单胞菌[25]、固氮菌[30-31]等的褐藻酸裂解酶；专一性裂解PolyG的PolyG裂解酶，如来自阴沟肠杆菌[32]、弧菌510[33]等的褐藻酸裂解酶，以及能同时裂解PolyM和PolyG的双功能裂解酶。鞘氨醇单胞菌菌种Sphingomonassp.A1产生三种褐藻酸内切酶（A1-I，A1-II，和A1-III），这些酶表现出不同的底物特异性：A1-II特异性降解褐藻酸PolyG，A1-III能特异性降解绿脓杆菌产生的乙酰化褐藻酸PolyM，而A1-I同时具有A1-II和A1-III的特性。

碳水化合物活性酶数据库（carbohydrate-activeenzymes，CAZY）根据氨基酸序列将多糖裂解酶划分到22个多糖裂解酶类（polysaccharide lyases，PLs）家族中。PLs是一类专一性识别多糖的糖醛酸残基，通过β-消去反应在非还原性末端形成含有C=C双键的不饱和寡糖的酶家族，可细化为24个家族，褐藻酸裂解酶分布在其中的7个家族中。大多数细菌产生的褐藻酸裂解酶属于PL-5和-7家族，分别具有PolyM裂解酶和PolyG裂解酶的特性，小球藻病毒和海洋动物产生的酶属于PL-14家族。大多数报道的褐藻酸具有内切酶的活性，两种新发现的褐藻酸裂解酶菌株Sphingomonas sp.A1产生的褐藻酸裂解酶A1-IV和A.Tumefaciens产生的褐藻酸裂解酶Atu3025具有外切酶的活性，被划分到PL-15家族，其他5个家族的酶具有内切酶活性。

1.3 褐藻酸裂解酶的结构

X-射线晶体学分别对菌株Sphingomonassp.A1产生的褐藻酸裂解酶A1-III（来自PL-5家族），菌株Corynebac teriumsp.产生的褐藻酸裂解酶（alginate lyases-1，ALY-1）（来自PL-7家族）和菌株A.tumefaciensC58产生的褐藻酸裂解酶Atu3025（来自PL-5家族）进行了空间结构的分析。A1-III的空间结构是由12条α-螺旋组成的（α6/α5）-桶状超二级结构蛋白，不存在β-折叠，其拓扑结构与葡萄糖淀粉酶和纤维素酶中的（α6/α6）-桶状结构相似[34]。A1-III分子中有一个管状的裂缝区域，褐藻酸分子渗入其中与催化残基发生相互作用。

PL-7家族的ALY-1裂解酶与A1-III裂解酶的空间结构完全不同，ALY-1是由14条β-折叠股形成的2个反向平行β-折叠（βI：β2、β1、β5、β14、β7、β8、β9、β10和βII：β4、β15、β6、β11、β12、β3）和2个α-螺旋组成，称为β-sandwich结构蛋白，与β-葡聚糖酶的β-jellyroll结构相似。多重序列分析结果表明PL-5和PL-7家族的序列相似性相对较低。然而，ALY-1和A1-III裂解酶都有一个包含底物结合位点的裂缝区域，裂缝中心的酪氨酸、组氨酸、精氨酸和天冬酰胺（或谷氨酰胺）残基空间排列极为相似且高度保守，两者可能是两种蛋白分子趋同进化的结果，这些高度保守的氨基酸对裂解酶的催化活性有重要作用。

图1 A1-III/ALY-1的空间结构(a)和催化残基(b)Fig.1 Spatial structure(a)and catalytic residues(b)of A1-III/ALY-1

PL-15为褐藻酸外切酶家族，与其他家族的裂解酶没有同源性。A.tumefaciensC58的Atu3025通过外切作用在底物末端形成不饱和单糖，该酶由776个氨基酸残基组成，分子量为87 ku。Atu3025以α-α-barrel结构和反向平行的β-折叠作为基本支架，其折叠方式也与其他褐藻酸裂解酶有很大的差异。OCHIAI A等[35]利用定点诱变的方法研究了Atu3025的酶促反应机理，α-α-barrel结构域中心存在一条较短的α-螺旋，该α-螺旋的构象在α-α-barrel结构域中心和C-末端结构域之间的界面上发生改变，这两个条件是Atu3025具备外切酶活性必不可少的结构因素。

1.4 褐藻酸酶解机理

1987年，GACESA P等[36]提出褐藻酸的酶解机理，褐藻酸裂解酶催化褐藻酸分子发生β-消去反应断裂4-O-糖苷键，在C4、C5之间形成双键，并在产物海藻寡糖的非还原性末端形成一个4-脱氧-L-赤-己-4-烯吡喃糖醛酸酯的不饱和单体，该单体在波长235 nm处有强吸收峰[37]。随后，GACESA P等[38]将研究重点转向褐藻酸裂解酶的作用机制，该机制包括三步反应：a.精氨酸和天冬酰胺中和羧基上的负电荷；b.通过广义酸碱催化，酪氨酸获取C5位上的质子；c.酪氨酸释放质子在C4与C5之间形成双键，导致4-O-糖苷键断裂，最终将褐藻酸分子裂解为一分子海藻寡糖和一分子不饱和单糖。

1.5 褐藻酸裂解酶在褐藻酸生物合成/降解中的功能

褐藻酸裂解酶在产褐藻酸的生物中具有重要的作用。绿脓杆菌P.aeruginosa是一种可以合成褐藻酸的机会性致病菌，常引起囊性纤维症（cystic fibrosis，CF）患者的肺部感染，褐藻酸被膜能有效抵挡宿主免疫系统和抗生素对绿脓杆菌的威胁。绿脓杆菌也可以产生褐藻酸裂解酶AlgL，在褐藻酸合成过程中，AlgL能调节褐藻酸聚合物的长度[39]并引导褐藻酸穿越胞外周质[40]。同时，AlgL也能通过降解褐藻酸被膜加快绿脓杆菌的扩散[41]。

图2 Sphingomonassp.A1胞内褐藻酸的降解途径Fig.2 Degradation pathway of alginic acid from the cell of Sphingomonassp.A1

大多数褐藻酸裂解菌产胞外褐藻酸裂解酶，褐藻酸首先在胞外降解，小分子海藻寡糖及单糖等降解产物再转运到胞内进行代谢。然而，有些褐藻酸裂解菌（如Sphingomonassp. A1）可以直接摄取褐藻酸大分子。Sphingomonassp.A1是国内外研究最全面的一株鞘氨醇假单胞菌，细胞膜上存在一个称为“super-channel”的转运系统。当菌体周围存在褐藻酸时，胞膜褶结构重排或流动形成的“pit”结构将褐藻酸聚集浓缩，在褐藻酸结合蛋白AlgQ1/AlgQ2和ATP结合盒引导下褐藻酸分子进入胞内。Sphingomonassp.A1的褐藻酸内切酶A1-I、A1-II和A1-III将褐藻酸降解为二糖、三糖和四糖，A1-IV具有外切酶活性，能将产生的海藻寡糖降解成不饱和糖醛酸，随后在有关酶系催化下转化为丙酮酸和甘油醛-3-磷酸。Sphingomonassp.A1胞内褐藻酸的降解途径如图2所示。

2 褐藻酸裂解酶的应用

不同来源的褐藻酸裂解酶在特异性、酶切方式和反应条件等方面有明显的差异，酶解产物海藻寡糖（含有3～25个糖醛酸单体）表现出众多不同的生物活性，如促进人体巨噬细胞分泌细胞因子，促进血管内皮生长因子介导的血管内皮细胞的生长和迁移，抗凝血，抑制肿瘤生长等功能。研究发现，海藻寡糖的活性与分子质量大小、组成以及寡糖链的结构有关。

在绿脓杆菌引起的CF患者肺部感染治疗上，2012年诺华公司开发的一种吸入式妥布霉素对患者的症状有一定的缓解，然而单一的抗生素会引起绿脓杆菌的抗药性。A1-III降解绿脓杆菌乙酰化的PolyM被膜，与抗生素配合治疗能从根本上杀灭绿脓杆菌。A1-III本身的抗原性很难直接作为药物应用于临床，有关研究尝试利用聚乙二醇修饰法及蛋白质工程技术[42]对A1-III进行修饰，抗原性有不同程度的降低或消失而且仍然保持较高的酶活力。

褐藻酸裂解酶还广泛应用于海藻原生质体的制备、控制多糖流变特性、清理污水生物膜和褐藻酸微细结构分析等。随着第三代生物燃料—“藻时代”的来临，褐藻酸裂解酶还将在海藻的糖化技术中发挥作用。

3 总结与展望

作为最重要的海洋工具酶之一，目前已有60多种不同来源的褐藻酸裂解酶被分离纯化。然而，现有的产酶菌株普遍存在酶活性和产量较低的问题，较难达到实际应用要求，酶基因的异源表达已成为获得高产褐藻酸裂解酶的主要手段。在酶的制备和研究中，加深菌株褐藻酸裂解酶表达系统的调控方式和酶与底物作用机理等问题的认识，将为褐藻酸裂解酶的工业化生产和应用奠定基础。

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Research progress of alginate lyase

SUN Yanbin,CHEN Hongji,JIANG Guoliang
(Shangdong Drug and Food Vocational College,Weihai 264210,China)

With the vigorous development of marine drugs and marine health products,the research of marine polysaccharide and its degradation products is focused on bioactive function.Alginate lyase can degrade alginate into alginate oligosaccharides(AOs),and the research on the AOs with multi new-type biological activities has become a research hotspot recently.The origin,classification,structure,biological function and enzymatic hydrolysis mechanism of alginate lyase were presented,and the application and prospects of alginate lyase were discussed as well.

alginic acid;alginate lyase;seaweed oligosaccharides

Q93

0254-5071（2017）03-0014-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.03.004

2016-10-29

国家自然科学基金资助项目（31101876）；山东省自然科学基金项目（ZR2010DQ012）

孙艳宾（1990-），女，助教，硕士，研究方向为生物化学与海洋生物活性物质。