褐藻胶寡糖的制备、分离及表征研究进展

刘以晴，马月云，刘宗浩，左依瑾，汪秋宽，武 龙，周 慧,3,

（1.大连海洋大学食品科学与工程学院，辽宁 大连 116023；2.河南工业大学粮油食品学院，河南 郑州 450001；3.大连工业大学海洋食品精深加工关键技术省部共建协同创新中心，辽宁 大连 116034）

褐藻胶（Alginate）是一种主要从海带、巨藻、裙带菜、马尾藻等褐藻中提取的水溶性酸性多糖[1−2]，棕色固氮菌、绿脓杆菌等微生物经培养也可产生褐藻胶[3]。据调查显示，褐藻胶的世界产量约为30000 t/年[4]。褐藻胶分子是由β-D-甘露糖醛酸（M）和α-L-古洛糖醛酸（G）两种同分异构单体通过1→4糖苷键连接而成的直链线型嵌段多糖，主要有均聚甘露糖醛酸（PM）、均聚古洛糖醛酸（PG）和异聚褐藻胶（PMG）三种排列方式[3,5]（见图1）。褐藻胶的M/G、分子量、乙酰化程度等结构特征，直接影响其粘度、凝胶性、水溶性等物理化学性质[6]。褐藻胶作为增稠剂、乳化剂、品质改良剂等食品添加剂广泛应用于食品加工领域。但是由于褐藻胶的分子量较大、凝胶性强、粘度大、不易被机体吸收，限制了其更多潜在的应用[7]。

图1 褐藻胶的结构单体G和M，褐藻胶的均聚片段polyM和polyG，以及杂聚片段polyMG/GM[3]Fig.1 Structural monomers G and M, homopolymer fragments polyM and polyG,and heteropoly fragment polyMG/GM of alginate[3]

褐藻胶寡糖（Alginate oligosaccharides，AOS）是由褐藻胶通过物理、化学及生物方法降解生成的、聚合度2～25的线性寡糖[3,8]。AOS由于分子量小、水溶性好，克服了褐藻胶粘度大、不易被机体吸收的缺点[9]，并且具有独特的保鲜[10]、抑菌性[11]、抗肿瘤[12]、抗氧化[13]、降血压[14]、降血糖[15]、促进植物生长[16]、诱导植物抗性[17]等多种生物活性，因此在食品、保健品、医药和绿色农业等领域的研究和应用得到了极大的发展。褐藻胶寡糖的生物活性与其结构密切相关，而降解方法和分离技术又直接影响着得到褐藻胶寡糖的分子量、化学结构和纯度等性质[18]。因此，本文对褐藻胶寡糖的制备方法、分离技术及结构表征进行了综述，并对其未来的发展提出了展望，以期为未来褐藻胶寡糖的应用和发展提供理论参考依据。

1 褐藻胶寡糖的制备

1.1 物理降解法

物理降解法是指通过辐射[19−20]、高温高压[21]等物理手段使褐藻胶中糖苷键断裂生成褐藻胶寡糖的方法。目前研究报道较多的物理降解法主要有辐射法和热液法。

1.1.1 辐射法 辐射降解法是褐藻胶在高能射线的作用下使糖苷键发生断裂，从而生成褐藻胶寡糖的一种方法[22]。

El-Mobby等[19]使用60Co的γ射线在剂量为20～100 kGy范围内照射褐藻胶，并加入化学引发剂过硫酸钾（KPS）产生协同效应，以提高褐藻胶降解的速率，减少降解所需褐藻胶的剂量。通过调节射线的照射剂量和照射时间，可以控制褐藻胶降解产物的分子量。Hu等[23]通过微波降解法降解褐藻胶，在130 ℃、纯水体系中使用1600 W微波降解褐藻胶15 min，得到了重均分子量为3200 Da的褐藻胶寡糖，寡糖产率为71%，发现制得的褐藻胶寡糖的重均分子量随着辐射时间的延长和降解温度的增加而显著降低，实现了褐藻胶寡糖的可控降解。Jankana等[20]使用紫外光照射1 g/L褐藻胶，加入二氧化钛（TiO2）作为催化剂，在pH7条件下反应3 h，最终得到产率达到90%、富含PolyMG/GM片段的褐藻胶寡糖。

辐射法不需要对环境进行特殊的控制，操作简单，使用的催化剂为二氧化钛，反应完成后过滤容易除去，绿色环保。但是由于利用辐射法定向制备褐藻胶寡糖的技术尚不成熟，还未应用于褐藻胶寡糖的大规模生产。

1.1.2 热液法 热液法分为水热法和溶剂热液法，其中水热法较为常见。在水热法降解过程中，首先将水加热使其超过临界点温度和压强，由于处于超临界状态的水具有溶解大量氧气、离子积大、粘度低、表面张力较低和扩散系数较高等特点，作为新型反应介质具有超级催化作用，能在短时间内降解褐藻胶[21]。

Matsushima等[24]采用超临界水法降解褐藻胶，在250 ℃下，1 s内可获得含有98%古洛糖醛酸的均聚物和富含甘露糖醛酸的水溶性杂聚物、重均分子量为670～770 Da的寡糖，通过改变反应压强和温度，可以控制制备寡糖的分子量和寡糖分子中M、G的相对含量。Aida等[25]利用热液法降解褐藻胶，发现降解过程中糖苷键的裂解有选择性，裂解顺序依次是同聚体MM、异聚体MG、同聚体GG，而不是在随机位点发生裂解，利用2.0 wt.%的褐藻胶水溶液在高温条件下（180～240 ℃）可降解成重均分子量为500～800 Da的寡糖，随着温度的升高会促进褐藻胶降解为单糖，同时导致单糖分解产生乳酸和乙酸等副产物。

热液法可以选择性的降解褐藻胶，实现定向制备褐藻胶寡糖，但是由于强烈的反应条件会导致褐藻胶过度分解而降低产率，产生过多的副产物。

1.2 化学降解法

化学降解法通过氧化剂、酸或碱与褐藻胶作用，使其中的糖苷键断裂而降解为褐藻胶寡糖的一种方法。目前化学降解法主要包括氧化降解法、酸降解法和碱降解法。

1.2.1 氧化降解法 氧化降解法常用的氧化剂有H2O2、NaClO、KMnO4、NaNO2等，并且在Cu2+、Fe2+等催化剂的协同作用下可以达到更好的降解效果[3]。其中H2O2作为氧化剂降解褐藻胶，绿色环保且成本低，易于实现工业化生产，是研究较深入的一种方法[21]。目前较为公认的H2O2降解机理为：H2O2产生羟自由基导致褐藻胶降解。羟自由基随机攻击褐藻胶糖链上任意糖残基C-1位上的氢，使分子重排并破坏1-4糖苷键，得到褐藻胶寡糖[26]。

H2O2作为氧化剂降解褐藻胶，反应速率受到氧化物浓度、反应时间、反应温度等因素的影响[27]。Yang等[26]使用浓度为5%的H2O2溶液降解经盐酸预处理的褐藻胶，在90 ℃下反应0.5～4 h，得到聚合度2～15的甘露糖醛酸寡糖，最大产率为58%，且随着降解时间的延长，低分子量片段逐渐增加；但是由于反应体系中含有H2O2，寡糖中还原端醛基大部分被氧化成羧基。Gan等[28]采用H2O2降解褐藻胶，0.5 mmol H2O2与40 mmol的Fe2+（芬顿试剂）混合，在37 ℃下反应10 h，得到聚合度为2～10的褐藻胶寡糖。李海波等[29]选用体积分数6%过氧化氢，在60 ℃下降解褐藻胶8 h，得到重均分子量为1000～6000 Da的褐藻胶寡糖，寡糖的产率可达到70%。曹柳[30]选用H2O2降解褐藻胶，得到褐藻胶降解的最佳条件是5%褐藻胶溶液与2% H2O2，在pH5.0、90 ℃反应2 h，得到聚合度为2～9的褐藻胶寡糖。

H2O2降解褐藻胶反应的唯一副产物是H2O，且没有其它杂质，因此被视为一种绿色降解方法，适用于生产低分子量的褐藻胶寡糖。但是依据现有的机理研究，H2O2对褐藻胶的降解位点随机，难以控制生成寡糖的结构，且H2O2具有强氧化性，反应过程中会破坏制备寡糖的还原基，影响寡糖的生物活性。

1.2.2 酸降解法 酸降解法是利用盐酸、草酸、甲酸等无机或有机酸对褐藻胶进行降解的一种方法。褐藻胶中的糖苷键在酸性条件下进行水解，首先糖苷氧质子化生成共轭酸；然后共轭酸杂化，形成碳氧鎓离子和非还原端；最后水分子迅速进入碳鎓-氧鎓离子中，形成还原末端[31]（如图2）。

图2 褐藻胶酸降解法的机理[31]Fig.2 Acid degradation mechanism of alginate[31]

Haug等[32]在100 ℃下使用1 mol/L的草酸降解褐藻胶10 h，得到了聚合度为10～30的甘露糖醛酸片段和古洛糖醛酸片段，寡糖的产率可达到80%。Chandia等[33]使用盐酸、硫酸和甲酸降解褐藻胶，在100 ℃利用90%甲酸降解褐藻胶6 h，并不能将褐藻胶完全降解，需用1.5 mol/L甲酸在100 ℃下继续反应2 h才能将褐藻胶完全降解，但甲酸降解比硫酸、盐酸降解效率高，且清洁。Leal等[34]在100 ℃用4.5 mL 90%的甲酸降解10 g/L的褐藻胶6 h，褐藻胶寡糖的产率可达到75%。胡博旸等[35]利用0.5 mol/L盐酸在90 ℃下降解褐藻胶10 h，得到甘露糖醛酸和古洛糖醛酸的总产率为70%，发现在前6 h内产物中还原糖的含量随时间的延长而增加。

酸降解法制备褐藻胶寡糖可以保留褐藻胶大分子中固有的结构特征，且一次降解可以获得系列聚合度的寡糖[21]。但是褐藻胶对无机酸的耐受性较强，很难将褐藻胶完全水解；且酸降解反应在较高温度下进行，反应剧烈不易控制。

1.2.3 碱降解法 碱降解褐藻胶的机理是β-消除反应，在碱性条件下褐藻胶的C-5失去质子，由于羧基诱导效应电子从C-4位转移到C-5位，促使1→4糖苷键断裂，并在降解产物的4→5位上形成一个与羧基共轭的双键[36]（如图3）。

图3 褐藻胶碱降解法的机理[36]Fig.3 Alkaline degradation mechanism of alginate[36]

Niemela等[37]在氮气条件下，分别在95 ℃和135 ℃利用0.5 mol/L和2 mol/L的NaOH溶液对褐藻胶处理2.5 h，发现褐藻胶在高浓度的碱液和较低温下会降解生成脱水异糖精酸、糖化异糖精酸和2-脱氧-3-C-甲基酒石酸，而在低浓度碱液中主要产物为2,3-二脱氧戊糖酸。Kristiansen等[38]在高碘酸钠的作用下，在37 ℃、pH10.4～10.3用0.0625 mol/L碳酸钙降解3 g/L的褐藻胶，得到重均分子量为1000 g/mol的褐藻胶寡糖。由于氧化残留物二元醛对碱非常敏感，所以经高碘酸盐氧化处理的褐藻胶比未氧化的褐藻胶在碱性条件下更容易降解。

碱降解法操作简单，但是其降解是通过β-消除反应实现的，会导致原多糖结构发生改变，且目标产物的生成量难以控制，易生成甲酸、乙酸、酒石酸等副产物[8]。

1.3 酶降解法

酶降解法是在褐藻胶裂解酶的作用下使褐藻胶中的1→4糖苷键断裂，从而制备褐藻胶寡糖的一种方法[39]。根据褐藻胶裂解酶对褐藻胶特定片段表现出的底物特异性，可将褐藻胶裂解酶分为：聚甘露糖醛酸特异性裂解酶（polyM）、聚古洛糖醛酸特异性裂解酶（polyG）和双功能裂解酶（polyMG）[3]。褐藻胶裂解酶一般来源于藻类、海洋微生物和海洋无脊椎动物等，其中对于来源于黄杆菌、弧菌、假交替单胞菌等海洋微生物的褐藻胶裂解酶的研究和应用最为广泛[3,40−42]。

Boucelkha等[43]在30 ℃下利用来源于黄杆菌、5个单位的聚古洛糖醛酸特异性裂解酶降解1.0%古洛糖醛酸片段6 h后，得到重均分子量为3742 g/mol、数均分子量为3219 g/mol的古洛糖醛酸寡糖。Li等[44]利用来源于弧菌SY08的、21.5 U/mg的内溶性双功能褐藻胶裂解酶AlySY08在40 ℃、pH7.6下，降解0.3%褐藻胶8 h，得到聚合度为2～5的褐藻胶寡糖，寡糖的产率可达到81%。Xie等[45]运用来源于假交替单胞菌NJ-21的、具备256 U/mg polyM、625 U/mg polyG和303 U/mg polyMG底物特性的褐藻胶裂解酶Al163，在40 ℃、pH7.0下降解0.2%褐藻胶8 h，得到富含二聚体和三聚体的褐藻胶寡糖。Chen等[46]利用来源于芽孢杆菌Alg07的聚甘露糖醛酸特异性褐藻胶裂解酶AlgA，在40 ℃、pH7.5下降解10 g/L的褐藻胶，得到聚合度2～4的褐藻胶寡糖和甘露糖醛酸寡糖。酶降解法制备褐藻胶寡糖的实例研究总结见表1。

表1 酶降解制备褐藻胶寡糖Table 1 Preparation of alginate oligosaccharides by enzymatic degradation

褐藻胶裂解酶来源广泛，酶活力高，专一性强、反应条件温和、耗能少、产物得率较高，可应用于褐藻胶寡糖的定向制备[46−48]。由于酶降解法得到的褐藻胶寡糖为生物活性高的不饱和寡糖，如图4所示，所以酶降解法是目前研究应用于制备褐藻胶寡糖的主要方法[49]。但是由于不同来源的褐藻胶裂解酶降解褐藻胶的机理和制备寡糖的结构不同。因此，需深入探索不同褐藻胶裂解酶与制备寡糖的结构和功能之间的关系。

图4 酶降解AOS结构[3]Fig.4 The structure of AOS by enzymatic degradation[3]

1.4 发酵法

发酵法是将褐藻胶与特定微生物培养，褐藻胶为微生物生长提供碳源，使微生物分泌褐藻胶裂解酶降解褐藻胶，而制备褐藻胶寡糖[3]。

Bang等[50]将枯草芽孢杆菌KCTC 11782BP菌株与含有1.0%褐藻胶共同培养，在37 ℃培养3 d得到的发酵产物加入到含有3%褐藻胶的培养基中，在37 ℃下培养14 d，得到平均聚合度为5的褐藻胶寡糖。此外，枯草芽孢杆菌KCTC 11872BP和3%褐藻胶在37 ℃下发酵14 d，可制得重均分子量低于10 kDa的褐藻胶寡糖[3]。Wang等[51]将斜纹芽孢杆菌M3和0.5（w/v）褐藻胶，同0.5% (NH4)2SO4、0.2 KH2PO4、0.1 MgSO4和0.002% FeSO4，在pH7.2、30 ℃下发酵24 h，得到聚合度2～4的褐藻胶寡糖。赵婉琳等[52]在25 ℃下将海科贝特氏菌HQZ08与7 g/L的褐藻胶共同培养24 h，得到聚合度为2～6的褐藻胶寡糖，寡糖的产率为32.15%。

与传统工业化酶法制备褐藻胶寡糖相比，发酵法制备褐藻胶寡糖成本低、操作简单。但是发酵法对于最优发酵条件和优质发酵工程菌的研究尚不成熟，目前产率较低，还需要开发更多活性高的褐藻胶降解菌株应用于发酵法制备褐藻胶寡糖[53]。

褐藻胶寡糖制备方法的优缺点总结见表2。

表2 褐藻胶寡糖制备方法Table 2 Preparation methods of alginate oligosaccharides

2 褐藻胶寡糖的分离纯化

不同结构和组成的褐藻胶寡糖具有不同的生物活性，由于褐藻胶降解产物是由不同分子量的寡糖组成的混合物，所以选用合适的分离方法分离获得高纯度的褐藻胶寡糖，对其构效关系的研究和应用尤为重要。目前褐藻胶寡糖分离纯化的方法主要有沉降分离法、膜分离法和色谱分离法等。

2.1 沉降分离法

沉降分离法是一种传统的、经典的分离方法。将寡糖混合物溶解到有机溶剂（如乙醇或丙酮）中，不同分子量的褐藻胶寡糖在有机溶剂中的溶解度不同，分子量较大的寡糖在较低浓度的有机溶剂中容易被沉淀出来，因此通过调整有机溶剂的浓度，可将不同分子量范围的寡糖进行分离[54]。

Hu等[23]利用沉降法对褐藻胶寡糖混合液进行初步分离，寡糖混合液通过80%的乙醇离心沉淀后，取上清液干燥再经凝胶渗透色谱分离得到10个寡糖组分。Zhang等[55]将乙醇加入到褐藻胶裂解酶降解制备的褐藻胶寡糖混合液中直至体积比为50%，沉降24 h后，取上清液蒸发，除去占体积比28%的褐藻胶衍生低聚糖，再经凝胶渗透色谱分离、紫外检测得到4个褐藻胶寡糖组分。

沉降分离法不需要特殊的设备，操作简单，且应用范围广泛，但其分离不完全，常用于褐藻胶寡糖混合物的初步分离。

2.2 膜分离法

膜分离是在滤膜两侧施加压力差、浓度差等推动力，使不同大小的物料选择性通过滤膜。膜分离近似于筛分过程，褐藻胶寡糖混合物通过膜时，由于不同分子量的寡糖体积不同，大于膜孔径的微粒被截留，小于膜孔径的微粒透过滤膜，从而实现寡糖混合物的分离[54,56]。

根据孔径的大小滤膜可分为微滤膜（MF）、超滤膜（UF）、纳滤膜（NF）、反渗透膜（RO）等[54]。欧昌荣等[57]通过超滤-纳滤两级膜分离发酵法制备的褐藻胶寡糖，发酵液经离心除去菌体后，取上清液先后利用MWC5000中空纤维膜超滤和MWC325纳滤膜纳滤，滤液经浓缩和冷冻干燥后，得到5个组分的褐藻胶寡糖，寡糖的回收率为94.0%、脱盐率为93.3%。Luan等[58]采用膜分离法分离辐射法降解制备的褐藻胶寡糖，经YM4（截留分子量MWCO30000）、YM3（MWCO10000）、YM2（MWCO3000）、YM1（MWCO1000）纤维膜超滤，得到5个组分，分析各组分的寡糖的分子量，发现随着辐照剂量的增加得到寡糖的分子量逐渐降低。Yang等[59]采用膜分离法分离褐藻胶寡糖混合物，经MWCO10000的超滤膜初步分离，截留分子量为10 kDa的褐藻胶寡糖。

膜分离法设备简单、启动快、不污染环境。但是膜分离法的分离效率易受到温度、压强、混合液浓度等因素的影响，其分离效果不易控制，且膜清洗的成本较高。

2.3 色谱分离法

分离组分中不同物质通过色谱柱，固定相对其吸附力不同，使其在色谱柱内移动速度不同，因而流出色谱柱的时间不同，从而达到分离的目的。色谱法具有分离效率高、检测灵敏度高、分析速度快、易于实现自动化的优点[54]。目前已经应用于褐藻胶寡糖分离的色谱分离法有凝胶渗透色谱法、离子交换色谱法、硅胶柱分离法、高效毛细管电泳法、薄层色谱法和荧光辅助糖电泳法等。

2.3.1 凝胶渗透色谱法（Gel Permeation Chromatography，GPC） 凝胶渗透色谱法是根据分子大小和形状来分离物质分子的一种非吸附方式的层析技术[30]。褐藻胶寡糖混合物在通过具有三维网络结构的凝胶时，因分子体积不同，通过的速度不同，体积大的寡糖速率快，分子小的寡糖速率慢，因此不同寡糖分子通过凝胶的时间不同而实现对不同体积的褐藻胶寡糖的分离[54]。

Aida等[25]利用GS-220HQ柱和GS-520HQ柱分离热液法制备的褐藻胶寡糖，采用流速1 mL/min 0.3 mol/L的NaNO3为流动相，得到甘露糖醛酸寡糖和古洛糖醛酸寡糖。陈岩君等[60]采用Bio-Gel P2柱分离酶降解制备的褐藻胶寡糖，以流速0.1 mL/min 2.5 mmol/L的NaCl为流动相，在230 nm处经紫外测定，得到聚合度均一的三个寡糖组分，寡糖聚合度为4～6。Ueno等[61]利用2.64 cm×100 cm的Bio-Gel P6凝胶柱分离褐藻胶寡糖，加入50 mol/L的磷酸缓冲液平衡到pH7.0，得到聚合度为2～8的褐藻胶寡糖。Chen等[46]采用Superdex Peptide 10/300柱分离的酶降解制备的褐藻胶寡糖，以流速0.4 mL/min 0.2 mol/L NH4HCO3为流动相，得到三个寡糖组分，寡糖聚合度为2～3。

凝胶渗透色谱法操作简单，条件温和，分离率高，且不需要有机溶剂，但这种方法对分子量的差异仅表现在流速的差异上，需严格控制流速，所以分析速度较慢，且凝胶渗透色谱不能分析分子量相近而结构不同的寡糖，适合分析分子量相差10%以上的寡糖[62]。

2.3.2 离子交换色谱分离法（Ion-exchange chromatography，IEC） 离子交换色谱法是以离子交换剂为固定相、利用被分离组分与固定相之间发生离子交换能力的差异而实现分离的一种液相色谱分离技术。离子交换色谱固定相上的离子基团可与褐藻胶寡糖游离的羧基结合，当用流动相洗脱时，寡糖按结合能力从小到大的顺序依次被洗脱下来，而达到分离的目的[63]。

Balance等[64]选用半制备离子型Pac-AS4A柱分离酸水解得到的褐藻胶寡糖，NaOH/NaAc进行洗脱，并通过脉冲安培检测技术（Pulsed-amperometric detection，PAD）对分离寡糖纯度进行检测，得到聚合度为5的寡糖，寡糖的纯度为96%。Li等[65]采用2 cm×35 cm的Pharmacia柱分离酶解法制备的褐藻胶寡糖，以0.2 mol/L的NaAc为洗脱剂，流速设置为1.0 mL/min进行梯度洗脱，在235 nm对分离产品进行紫外检测，得到包括二糖和三糖的6种寡糖。Peng等[66]采用TSK-GEL DEAE-2SW柱分离褐藻胶寡糖混合物，以0～0.25 mol/L的NaCl作为流动相进行梯度洗脱，流速为7 mL/min，洗脱液在波长230 nm进行紫外检测，分离得到12个褐藻胶寡糖组分，各组分的纯度均高于97%。

离子交换色谱法具有样品用量少、分离效率高、灵敏度高的优点，适用于分离酸性寡糖，但是其定性能力差，可与其它色谱法联用提高分离纯化效果[63]。

2.3.3 硅胶柱分离法 硅胶柱分离法主要是利用硅胶载体对于不同极性的物质结合吸附的程度不同，而实现分离的一种方法。不同聚合度的褐藻胶寡糖极性不同，一般情况下，极性较大的物质容易被硅胶载体吸附，而极性较弱的物质不易被硅胶载体吸附，因此，褐藻胶寡糖混合物因吸附程度不同而达到分离[67]。

黄菊等[68]利用粒度为200～300目的柱层析硅胶柱对酶解产生的褐藻胶寡糖进行分离，将200 mg褐藻胶寡糖同5 g硅胶一起加入10 mL蒸馏水中混匀，于35 ℃的烘箱中烘干，洗脱至洗脱液（洗脱液为甲醇:水:正丁醇:醋酸系统）中无糖检出，洗脱液经蒸发浓缩后通过薄层色谱法（TLC）测定得到4个褐藻胶寡糖组分，各组分已经被分为两种或三种寡糖的混合物，每个组分再次分别进行硅胶柱分离，通过MALDE-TOF-MS测定得到分子量为1000～8000 Da的寡糖，且每种寡糖已经得到基本的分离。王红敏[69]使用粒度为200～300目的柱层析硅胶分离褐藻胶寡糖，将500 mg褐藻胶寡糖同1 g硅胶一起加入1 mL蒸馏水中混匀，于35 ℃的烘箱中烘干，以正丁醇:甲酸:水（4:6:1，v/v）为洗脱剂洗脱混合液至无糖检出，浓缩蒸发后经质谱测定得到4个寡糖组分，各个寡糖组分进行第二次硅胶柱分离，利用TLC分析发现聚合度为2～5的寡糖达到基本分离，且三糖的纯度最大。

硅胶柱分离法操作简便，不需要昂贵的仪器设备，成本低，但是由于其洗脱液大多含有大量的有机溶剂，易造成环境污染。

2.3.4 高效毛细管电泳法（High Performance Capillary Electrophoresis，HPCE） 高效毛细管电泳法是依据在高压电场中，不同物质在毛细管分离通道中的淌度和分配行为不同而进行分离的一种方法[70]。不同的褐藻胶寡糖带电荷不同，在均一的缓冲溶液体系中，由于电泳的淌度不同而分离成单一的区带，而达到分离纯化的效果[63]。

孙燕[71]选用有效长度为48 cm、内径50 μm的熔融石英管为毛细管，通过HPCE分离酶降解制备的褐藻胶寡糖。在进样压力为50 mbar、分离温度为30 ℃下进行分离，在235 nm处进行紫外检测，得到4个寡糖组分，分别为二糖、三糖、四糖和五糖，且具有较高的纯度。张真庆[63]采用高效毛细血管电泳法分离酶降解产生的寡糖，在电压为20 kV、温度为25 ℃下，用分离长度为40 cm内径为50 μm未涂层的石英毛细管进行分离，在235 nm处进行紫外在线检测，得到4个褐藻胶寡糖组分，各组分的纯度分别是85.23%、84.73%、97.77%、95.25%。

高效毛细管电泳法分析时间短、耗样少，进样量可达纳升级，适用于微量试样的分离纯化，但是由于会电渗导致样品组成发生变化，从而影响分离效果[71]。

褐藻胶寡糖分离技术的优缺点总结见表3。

表3 褐藻胶寡糖的分离技术Table 3 Separation technology of fucoidan oligosaccharides

3 褐藻胶寡糖的表征

3.1 纯度分析

荧光辅助糖电泳法是利用可以提供荧光电荷和基团的衍生剂，使寡糖衍生化而携带荧光基团和电荷，然后经过电泳使不同聚合度的寡糖单体呈现单一的条带，并对其进行纯度分析的一种方法[67]。

王莹等[72]采用荧光辅助电泳法对稀酸降解制备的褐藻胶寡糖进行分析，将寡糖混合物溶于含5 mg 7-氨基萘-1,3-二磺酸（ANDS）、15% HAc中，在室温下避光静止1 h后，加入硼氢化钠在45 ℃反应12 h，经Sephadex G25柱脱盐，得到的标有荧光的寡糖进行梯度电泳，结果显示一条单带，表明得到的寡糖纯度较高。刘斌等[73]采用荧光辅助糖电泳法分析酸降解法制备的褐藻胶寡糖，将100 μg的寡糖利用7-氨基萘-1,3-二磺酸荧光标记后进行分析，结果呈现较清晰的双条带，表明测定的样品纯度较高；经进一步分析证实，测定组分分子量越大，电泳距离越短，并且按聚合度大小分布成连续的梯状。

荧光辅助糖电泳法是一种简单、快捷的分析方法，可以获得分子量信息，使检测结果更加直观有效。但是如果寡糖中存在较多相似的化学组成或异构体，采用荧光辅助糖电泳法分析难度很大，且会产生较大的误差。因此荧光辅助糖电泳法适用于分析结构组成不同的寡糖[72]。

3.2 结构鉴定

由于褐藻胶寡糖的结构直接影响着其理化性质与生物活性，所以对褐藻胶寡糖结构的表征尤为重要。褐藻胶寡糖的结构鉴定包括测定寡糖中寡糖聚合度（分子量），M、G的相对含量即M/G，及寡糖中均聚、异聚片段组成、含量等。目前广泛使用的结构表征方法包括凝胶渗透色谱法、薄层色谱法、红外吸收光谱、圆二色谱、质谱、核磁共振波谱等。

3.2.1 薄层色谱法（Thin Layer Chromatography，TLC）薄层色谱法是利用褐藻胶通过吸附剂时，会不断地产生吸附-解吸过程，不同聚合度的褐藻胶寡糖对同一吸附剂的吸附能力不同，根据比移值（Rf）与适宜的对照物按同法所得的色谱图的比移值（Rf）作对比，从而分析褐藻胶寡糖的聚合度[54]。

Zhu等[74]利用1-丁醇:乙酸:水（3:2:2, v/v）的溶剂体系对褐藻胶寡糖进行薄层色谱分析，得到了三个组分的寡糖，寡糖的聚合度为5～7。Zhu等[75]以1-丁醇:乙酸:水（3:2:3，v/v）作为溶剂体系，采用薄层色谱法对酶降解制备的褐藻胶寡糖进行分析测定，得到了聚合度为2～4的褐藻胶寡糖。Zhuang等[76]使用1-丁醇:甲酸:水（4:6:1，v/v）的溶剂体系对褐藻胶裂解酶降解制备的褐藻胶寡糖进行薄层色谱分析，发现褐藻胶裂解酶AlyAa降解制备的褐藻胶寡糖为二糖、三糖、四糖，其中三糖是主要产物；褐藻胶裂解酶AlyAb降解制备的褐藻胶寡糖主要为三糖、四糖和五糖。薄层色谱法还可以通过测定褐藻胶中还原糖含量的变化，作为褐藻胶在降解过程中是否完全降解的参考[77]。

薄层色谱分析法操作简单、分析速度快、成本低，适用于寡糖的快速分析。但是定量分析时误差较大，通常只用做定性分析。

3.2.2 红外吸收光谱法（Infrared Absorption Spectroscopy，FTIR） 红外吸收光谱是根据不同结构的官能团吸收不同波长的红外射线，而对物质组分进行分析和鉴定的一种方法。红外吸收光谱法主要鉴定寡糖中糖环骨架和官能团，一般用于褐藻胶寡糖结构的初步表征[54]。

王莹等[72]采用红外吸收光谱法对褐藻胶寡糖进行分析，发现在950 cm−1出现的吸收峰对应于吡喃糖环的非对称伸缩振动，在1613 cm−1和1416 cm−1的吸收峰分别对应于羧基的非对称和对称的伸缩振动，证明寡糖结构中含有糖醛酸单元。Chandia等[33]利用红外吸收光谱分析酸降解制备的聚古洛糖醛酸片段和聚甘露糖醛酸片段，发现在947、903、813、780 cm−1处有古洛糖醛酸糖环的特征吸收峰；在893、822 cm−1处有甘露糖醛酸糖环的特征吸收峰。Xu等[78]利用红外吸收光谱测定酶降解制备的褐藻胶寡糖，分别在789和821 cm−1处出现特征吸收峰，表明寡糖中含有古洛糖醛酸糖环和甘露糖醛酸糖环。Falkeborg等[79]利用红外吸收光谱对褐藻胶寡糖的结构进行表征，发现在1700 cm−1处存在C=O的不对称伸缩振动，比羧酸的振动频率大，证实一些羧基仍以羧酸盐的形式存在。褐藻胶寡糖的特征红外吸收峰总结见表4。

表4 红外吸收光谱对褐藻胶寡糖的表征Table 4 Characterization of alginate oligosaccharides by infrared absorption spectroscopy

红外吸收光谱可用于不同组成褐藻胶寡糖结构的初步分析和表征，仪器操作简单、测量精度高、分析速度快。但是水中的羟基会干扰测定，不适合测定水分含量高的样品。定量分析时误差较大，一般用于褐藻胶寡糖的定性分析。

3.2.3 圆二色谱法（Circular Dichroism，CD） 圆二色谱是根据光学活性物质对偏振光的吸收率不同，来推断物质非对称分子构象的一种旋光光谱。圆二色谱一般用于测定褐藻胶寡糖分子的M/G[54]。

Morris等[80]采用圆二色谱法对聚古洛糖醛酸和聚甘露糖醛酸的结构进行测定，通过分析波谱中的分子椭圆度，得到样品中M/G值为29:71。Sim等[81]利用圆二色谱对酸降解制备的、沉淀分离后的褐藻胶寡糖进行分析，通过波谱的椭圆率计算各嵌段的长度，得到褐藻胶寡糖M/G值为9:8。

圆二色谱法操作简单，测定速度快，灵敏度高，是糖类化合物进行结构鉴定常用的一种方法。但是光吸收杂质的存在会干扰圆二色谱的测定，所以测定样品需要保证一定的纯度。

3.2.4 质谱法（Mass Spectroscopy，MS） 质谱法是根据不同物质组分的质荷比不同，而对样品结构进行分析和测定的一种方法。质谱法一般用于测定褐藻胶寡糖的糖链结构和分子量，是寡糖结构鉴定的重要方法之一[54]。

Falkeborg等[79]采用质谱法对酶降解制备的褐藻胶寡糖进行分析，寡糖通过沉淀分离后，经ESITOF-MS测定，结果显示寡糖的聚合度为2～4，非还原末端由4-脱氧-erythro-hex-4-烯醇式吡喃糖醛酸盐组成。Peng等[66]采用ESI-MS法对离子交换色谱分离得到的聚合度为2～5的4个寡糖组分进行分析，发现4个组分寡糖的结构组成分别是G 、∆MG、（寡糖结构片段）。Zhu等[82]对酶降解制备的褐藻胶寡糖进行测定，寡糖经沉淀分离后，通过ESI-MS分析测得制备褐藻胶寡糖聚合度为2～4，并发现GGGG是能被褐藻胶裂解酶FsAlgB识别和切割的最短底物。Fischer等[83]对酶降解制备的褐藻胶寡糖进行测定，寡糖经离子交换色谱分离后，通过AXP-MS进行测定，发现寡糖中只含有不饱和古洛糖醛酸片段，证明褐藻胶裂解酶CaAIy1为聚古洛糖醛酸特异性裂解酶。Pei等[84]采用MS分析凝胶渗透色谱分离的褐藻胶寡糖，测定得到寡糖的重均分子量分别为352、528、704、880、1056 Da。

质谱法测定速度快，灵敏度高，样品用量少。通常采用串联质谱法以提高分析的精度和准确度[85]。

3.2.5 核磁共振波谱法（Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy，NMR） 核磁共振波谱法是利用特定的原子核在给定的磁场中，只吸收特定射频辐射形成核磁共振信号，从而进行结构鉴定[86]。通过糖残基中各位点元素的化学位移产生的信号可以获得褐藻胶寡糖的结构信息，通过信号峰面积的积分可得到残基的相对含量[54]。

Penman等[87]分析酸降解制备的、经沉淀分离后的褐藻胶寡糖，利用1H-NMR光谱测定寡糖中的甘露糖醛酸和古洛糖醛酸嵌段，通过计算各嵌段峰面积，得到古洛糖醛酸片段和甘露糖醛酸片段的比值为0.32，且褐藻胶寡糖中均聚的甘露糖醛酸片段与杂聚片段大致相等。Liu等[3]通过酶降解制备褐藻胶寡糖，经离子交换色谱分离纯化后得到2个组分，通过分析13C-NMR波谱中元素化学位移产生的信号，与已知分子量的样本波谱对比，测得寡糖的重均分子量分别为396和594 Da。Guo等[88]利用1H-NMR光谱测定经凝胶渗透色谱分离的褐藻胶寡糖，得到甘露糖醛酸片段与古洛糖醛酸片段的比值是1:2.6。Sun等[89]利用1H-NMR光谱测定经凝胶渗透色谱分离后的褐藻胶寡糖，通过比较寡糖和标准样品的嵌段峰，计算得到褐藻胶寡糖的平均聚合度为10。Chen等[90]通过酶降解制备的褐藻胶寡糖，经凝胶渗透色谱分离后得到4个组分，通过分析1H-NMR光谱在JHH=8.6 Hz和JHH=8.4 Hz出现的单峰，发现组分1只含∆G寡糖片段，组分2含∆GG和∆MG两种寡糖片段，组分3含∆GGG、∆GMG、∆MGG和∆MMG四种寡糖片段。

核磁共振波谱法测定消耗样品量少，且不会破坏样品，可回收样品，是一项发展较成熟的结构测定技术。但是核磁共振波谱需要纯度较高的分析物才能得到确定的光谱，并且需要较高浓度的褐藻胶寡糖才能进行明确的结构分析[3]。

褐藻胶寡糖表征方法的优缺点总结见表5。

表5 褐藻胶寡糖的表征方法Table 5 Characterization methods of alginate

4 结语与展望

褐藻胶寡糖的组成和结构直接影响着其生物活性，而通过不同制备方法可生成不同结构的褐藻胶寡糖。目前褐藻胶寡糖可以通过物理、化学、酶降解、发酵等方法制备，其中酶降解法得到的褐藻胶寡糖是C4和C5处具有双键的不饱和寡糖，且产物得率高、绿色无污染，是现在研究和应用较为广泛的一种制备褐藻胶寡糖的方法，未来发展方向为可定向制备特定结构褐藻胶寡糖高活力酶的研发。褐藻胶寡糖混合物可以通过沉降分离法、膜分离法、色谱分离法等方法分离。色谱分离法灵敏度高、分离效率高、易于实现自动化，是实验室研究较为广泛的一种方法，未来可应用于工业自动化分离。褐藻胶寡糖的纯度、分子量、M/G及其连接方式等特征可以通过荧光辅助糖电泳法、凝胶渗透色谱法、薄层色谱法、红外吸收光谱、圆二色谱、质谱、核磁共振等方法进行表征。各种结构表征方法各有优缺点，未来发展趋势是多种方法联用，实现更高效、快速的表征褐藻胶寡糖。

褐藻胶寡糖的制备方法、分离技术和表征方法的发展，对褐藻胶寡糖的合理应用有着深远的意义。相信未来可以实现褐藻胶寡糖的定向制备、高效精准分离和表征，使其在食品、医药和农业等领域发挥更加重要的作用。