叶生小皮伞菌的生物学特性研究
2018-12-01穆双双刘俊泽王淑敏
娄 玲，穆双双，胡 德，汤 磊，刘俊泽，王淑敏
（长春中医药大学，吉林 长春 130117）
叶生小皮伞，学名Marasmius epiphyllus（Pers.)Fr.，属于伞菌纲（Agaricomycetes） 伞菌目 （Agaricales） 小 皮 伞 科 （Basidiomycetes） 小 皮 伞 属（Marasmius） 真菌[1]。主要形态特征是：担子果小，菌盖坚韧，在菌褶和菌柄间时有一“项圈”（collar）；孢子卵形至椭圆形，光滑，无色，非淀粉质反应[2-3]。夏秋季生于林内落叶上或地上，分布于我国吉林、福建、广西等地[4]。
近年我国对小皮伞的研究不多，仅在一些野外调查报告中会提及少数种，如图力古尔[5]、吴兴亮等[6]对个别种类的报道[7]，几乎没有其他关于叶生小皮伞菌研究的相关报道。通过单因素考察和正交试验，确定了叶生小皮伞菌生长最适宜的碳源、氮源、微量元素和生长条件，为叶生小皮伞菌的进一步研究和开发奠定基础。
1 材料与方法
1.1 供试材料
1.1.1 供试菌株
叶生小皮伞菌株，由长春中医药大学菌物药研究室提供。
1.1.2 仪器
LDZX-50KBS高压灭菌器，上海申安医疗器械厂；超净工作台，苏州净化设备厂；WMK-02型电热恒温培养箱，湖北省黄石市医疗器械厂；303AB-2恒温培养箱，上海申光仪器仪表有限公司；AUY220万分之一分析天平，岛津制作所。
1.1.3 试剂
葡萄糖购自西陇科学股份有限公司；硫酸铵购自天津市美华泰克科技有限公司；脲购自广东汕头市西陇化工厂；VB1购自大同市云冈制药有限公司；KH2PO4购自西陇化工有限股份公司；乳糖、蔗糖、硝酸铵、HCl、NaOH、豆饼粉、麦麸、玉米粉和乙醇均购自北京化工厂；木糖、琼脂粉、MgSO4和Ca CO3均购自天津市光复精细化工研究所；麦芽糖、蛋白胨和酵母浸粉均购自北京奥博星生物技术有限责任公司。
1.1.4 培养基的组成
碳源基础培养基：马铃薯20%、琼脂2%、KH2SO40.15%、MgSO40.1%，pH自然。
氮源基础培养基：玉米粉浸汁4%、马铃薯20%、琼脂2%、KH2SO40.15%、MgSO40.1%，pH自然；蔗糖2%、马铃薯20%、琼脂2%、KH2SO40.15%、MgSO40.1%，pH自然；葡萄糖2%、马铃薯20%、琼脂2%、KH2SO40.15%、MgSO40.1%，pH自然。
微量元素基础培养基：玉米浸汁4%、硝酸铵0.2%、马铃薯20%、琼脂2%，pH自然；蔗糖2%、酵母粉1%、马铃薯20%、琼脂2%，pH自然。
正交培养基优化试验：分别以蔗糖、酵母、Mg SO4以及KH2PO4为因素，按表1的L9（34）正交表的比例制备培养基。
pH试验所用培养基为马铃薯20%、蔗糖1%、酵母粉0.5%、KH2PO40.1%、MgSO40.05%。
温度试验所用培养基为马铃薯20%、蔗糖1%、酵母粉0.5%、KH2PO40.1%、MgSO40.05%。
1.2 试验方法
菌株经连续20代的传代培养后，菌丝形态和长势基本不变，在4℃环境下保存约1个月，菌丝形态依然一致，就可以确定叶生小皮伞菌株已基本纯化，可用于试验。每组按培养基组成，平行配制3支试管，经高压蒸汽灭菌后，无菌操作切出大小为0.25 cm2的菌块接于培养基上，置于27℃恒温培养箱中。自萌发日开始每日记录菌丝状态，测量菌落面积，比较菌丝生长速度[8]。
1.2.1 碳源的影响
碳源依次为：空白、葡萄糖浓度2%、蔗糖浓度2%、木糖浓度2%、乳糖浓度2%、麦芽糖浓度2%、玉米面浸出液浓度4%。共7组考察试验。
1.2.2 氮源的影响
氮源依次为：空白、酵母粉浓度1%、蛋白胨浓度2%、豆饼粉浸汁浓度 4%、麦麸浸汁浓度4%、尿素浓度0.2%、硫酸铵浓度0.2%、硝酸铵浓度0.2%。共8组考察试验。
1.2.3 微量元素的影响
微量元素依次为：空白、MgSO4浓度0.15%、KH2PO4浓度0.15%、VB1浓度0.05%、NaH2SO4浓度0.15%、CaO浓度0.1%、MgSO4浓度 0.10%以及KH2PO4浓度0.15%。共8组考察试验。
1.2.4 培养基优化试验
按营养元素考察结果进行筛选，按表1的L9（34）正交表比例来制备培养基。
表1L9（34）正交试验因素水平Tab.1 Factor level of L9(34)orthogonal test
1.3 培养条件对菌株生长的影响
1.3.1 pH对菌株生长的影响
按正交试验得出的最优培养基配比制备培养基，用0.1 mol·L-1HCl和 20%NaOH调节 pH，使其 pH分别为 5.0、 5.5、 6.0、 6.5、 7.0、 7.5、 8.0、 8.5、9.0。
1.3.2 温度对菌株生长的影响
按正交优化试验结果制备培养基，放置于不同温度下，温度分别为15℃、20℃、25℃、30℃。
2 结果与分析
2.1 碳源对菌株生长的影响
碳源对叶生小皮伞菌菌株生长速度的影响结果见表2、图1。
由表2和图1可以看出，6种碳源中菌株均可生长，其中玉米粉、蔗糖、葡萄糖3种碳源中叶生小皮伞菌能以较快的速度生长，且长势旺盛、无杂菌污染，因此分别以玉米粉、蔗糖、葡萄糖3种碳源作为基础碳源进行氮源的考察。
表2 不同碳源对叶生小皮伞菌生长速度的影响Tab.2 Effects of different carbon sources on the growth rate of Marasmius epiphyllus
图1 不同碳源培养基中叶生小皮伞生长速度的变化Fig.1 Changes of growth rate of Marasmius epiphyllus in different carbon source mediums
2.2 不同氮源对菌株生长的影响
玉米粉浸汁组、蔗糖组、葡萄糖组不同氮源对菌株生长速度的影响结果分别见表3和图2、表4和图3、表5和图4。
由表3和图2可知，在玉米粉浸汁组中，除以尿素为氮源外，其余6种氮源中叶生小叶皮伞菌株均可正常生长，其中以蛋白胨为氮源时菌株生长速度最快，其次是硝酸铵，二者相比菌株长势相近，但以硝酸铵为氮源的菌丝较以蛋白胨为氮源的菌丝更加浓厚，因此玉米浸汁组选择硝酸铵为最佳氮源。
表3 玉米粉浸汁组不同氮源对叶生小皮伞菌生长速度的影响Tab.3 Effects of different nitrogen sources on the growth rate of Marasmius epiphyllus in corn flour juice group
表4 蔗糖组不同氮源对叶生小皮伞菌生长的影响Tab.4 Effects of different nitrogen sources on the growth of Marasmius epiphyllus in the sucrose group
表5 葡萄糖组不同氮源对叶生小皮伞菌生长速度的影响Tab.5 Effects of different nitrogen sources on growth rate of Marasmius epiphyllus in glucose group
图2玉米浸汁组不同氮源培养基中叶生小皮伞生长速度的变化Fig.2 Changes of growth rate of Marasmius epiphyllus in different nitrogen source mediums in corn dip juice group
图3 组不同氮源培养基中叶生小皮伞生长速度的变化Fig.3 Changes of growth rate of Marasmius epiphyllus in different nitrogen source mediums in sucrose group
图4 糖组不同氮源培养基中叶生小皮伞生长速度的变化Fig.4 Changes of growth rate of Marasmius epiphyllus in different nitrogen source mediums in glucose group
由表4和图3可知蔗糖组中，除以尿素为氮源外，其余6种氮源中叶生小伞皮菌株均可正常生长，其中以麦麸汁为氮源时菌株生长速度最快，其次是酵母粉，虽然二者相比长势相近，但以酵母粉为氮源的菌丝比以麦麸汁为氮源的菌丝更加浓厚，因而蔗糖组的最佳氮源选择酵母粉。
由表5和图4可知，除以尿素为氮源时叶生小皮伞菌株生长较慢外，其余6种氮源中菌株均可快速生长，其中以硝酸铵为氮源时菌株生长速度最快，其次是麦麸汁，虽然二者相比长势相近，但以麦麸汁为氮源的菌丝更加浓厚，因而葡萄糖组最佳的氮源为麦麸汁。
综合比较3组，葡萄糖组的菌丝生长速度不如玉米浸汁组和蔗糖组，菌丝也没有其他2组浓密，因而舍弃葡萄糖组。氮源组最终筛选的结果为玉米粉浸汁加硝酸铵、蔗糖加酵母粉，并以此为基础进行微量元素的考察。
2.3 微量元素对菌株生长的影响
玉米粉浸汁加硝酸铵组、蔗糖加酶母粉组不同微量元素对叶生小皮伞菌丝生长的影响结果分别见表6和图5、表7和图6。
由表6和图5可知玉米浸汁加硝酸铵组中，除添加CaO抑制叶生小皮伞菌株生长外，添加其余5种微量元素时菌株均可快速生长，其中以VB1为微量元素的菌株生长速度最快且菌丝浓厚，因此玉米浸汁加硝酸铵组中，最佳微量元素为VB1。
由表7和图6可知蔗糖加酶母粉组中，除添加CaO的菌株生长速度较慢外，添加其余5种微量元素时菌株均可快速生长，其中以MgSO4加KH2PO4为微量元素的菌株生长速度最快且菌丝浓厚，因而蔗糖加酶母粉组中，选择MgSO4加KH2PO4为最佳的生长元素。
表6 玉米粉浸汁加硝酸铵组不同微量元素对叶生小皮伞菌生长速度的影响Tab.6 Effects of different trace elements on the growth rate of Marasmius epiphyllus in corn flour juice and ammonium nitrate group
表7 蔗糖加酵母粉组不同微量元素对叶生小皮伞菌生长速度的影响Tab.7 Effects of different trace elements on the growth rate of Marasmius epiphyllus in sucrose and yeast extract group
图5 玉米浸汁加硝酸铵组不同微量元素中叶生小皮伞生长速度的变化Fig.5 Changes of growth rate of Marasmius epiphyllus in different trace element mediums in corn flour juice and ammonium nitrate group
综合比较2组，2组长势相近，但蔗糖加酶母粉组的菌丝较玉米浸汁加硝酸铵组的更加浓厚，因此舍弃玉米浸汁加硝酸铵组，最终的培养基组成为蔗糖、酵母粉、MgSO4
加KH2PO4。
2.4 正交培养基优化试验
正交培养基优化试验结果极差分析结果见表8、方差分析结果见表9。
图6 蔗糖加酵母粉组不同微量元素培养基中叶生小皮伞生长速度的变化Fig.6 Changes of growth rate of Marasmius epiphyllus in different trace element mediums in sucrose and yeast extract group
通过表9可以得出，4种因素对叶生小皮伞菌株的影响顺序是：蔗糖＞MgSO4＞酵母粉＞KH2PO4。最终确定最优培养基组成的配比为：蔗糖浓度1%、酵母粉浓度0.5%、MgSO4浓度为0.05%、KH2PO4浓度为0.1%。
2.5 不同pH对菌株生长的影响
不同pH对菌株生长的影响结果见表10、图7。
由表10和图7可知，叶生小皮伞菌在pH值为5～6的范围内生长速度最快、长势旺盛，pH值越大，菌株生长速度越缓慢，因此表明叶生小皮伞菌更适宜在弱酸性条件下生长。
2.6 不同温度对菌株生长速度的影响
表8 正交试验培养基优化结果的极差分析表Tab.8 Range analysis table for optimization results of orthogonal test medium
表9 方差分析表Tab.9 Variance analysis table
表10 不同pH对叶生小皮伞菌生长的影响Tab.10 Effects of different pH on the growth of Marasmius epiphyllus
不同温度对菌株生长速度的影响，结果见表11、图8。
图7 不同pH的叶生小皮伞生长速度变化Fig.7 Changes in growth rate of Marasmius epiphyllus with different pH
表11 不同温度对叶生小皮伞菌生长速度的影响Tab.11 Effect of different temperatures on the growth rate of Marasmius epiphyllus
图8 不同温度叶生小皮伞生长速度变化Fig.8 Changes in growth rate of Marasmius epiphyllus with different temperatures
由表11和图8可知，叶生小皮伞菌最适温度为25℃～30℃，温度过低和过高时会抑制叶生小皮伞菌的生长。
3 结论
以叶生小皮伞菌丝的生长速度为考察指标，研究不同条件对叶生小皮伞菌生长速度的影响，确定了叶生小皮伞菌在pH为5～6、温度为25℃～30℃的条件下，生长速度较快。根据正交培养基优化试验，最终确定叶生小皮伞菌最适生长条件为：蔗糖浓度1%、酵母粉浓度0.5%、MgSO4浓度0.05%、KH2PO4
浓度0.1%，pH为5～6，温度为25℃～30℃。碳氮源为真菌菌丝体提供了生长和代谢所需的营养物质[9]，通过对碳源、氮源的考察试验发现，除氮源中的尿素和微量元素中的氧化钙对叶生小皮伞菌株生长产生抑制外，其余物质均可使叶生小皮伞菌以较快速度生长，这表明叶生小皮伞菌株的生长力旺盛。蔗糖、玉米浸汁、葡萄糖中菌株均可以较快速度生长，说明菌株可利用的碳源广泛。从条件因素考察得知，叶生小皮伞菌喜好弱酸性环境，强碱环境会抑制叶生小皮伞菌株的生长。试验筛选出最适宜叶生小皮伞菌生长的条件，为叶生小皮伞菌进一步的研究与开发奠定了基础。
