黑柴胡提取物对老年痴呆小鼠模型认知功能和脑内神经炎症的作用研究*

李 娟，姚 遥，洪 洲，李 南，郑 萍，赵启跃

1.宁夏医科大学药学院，回医药现代化教育部重点实验室(银川 750004)，2. 宁夏医科大学基础医学院(银川 750004)，3. 延安大学附属医院临床药学科(延安 716000)

主题词 黑柴胡 老年痴呆 认知功能 神经炎症

阿尔茨海默病(Alzheimer's disease，AD)，是一种中枢神经系统退行性疾病，其临床主要特征包括记忆障碍、认知功能障碍、人格和行为改变等[1-2]。AD的发病机制十分复杂，近年来越来越多的研究证实，小胶质细胞活化诱发的慢性神经炎症反应是AD的主要病因之一[3]。中药黑柴胡为伞形科柴胡属植物黑柴胡或小叶黑柴胡的干燥根，主要分布于内蒙、甘肃、青海等地区，在我国西北地区常用作柴胡的代用品。据文献报道[4]，黑柴胡中主要含有黄酮、皂苷类、木脂素、多糖及甾醇等类型化合物，具有抗炎、解热、镇痛、保肝等药理活性。其中，黑柴胡的抗炎作用尤为突出，有研究表明，黑柴胡和北柴胡的水煎液均能明显抑制二甲苯所致小鼠耳壳肿胀，且二者的抗炎作用没有显著性差异[5]。基于神经炎症在AD发病中的重要作用，我们推测具有显著抗炎效果的黑柴胡可能对AD有治疗作用。因此，本文通过侧脑室注射LPS建立神经炎症AD小鼠模型，考察黑柴胡提取物对AD小鼠认知功能和脑内神经炎症的作用，以期为黑柴胡的进一步开发和临床应用提供参考。

材料与方法

1 实验药物 黑柴胡于2016年3月购自亳州药材市场，经宁夏药品检验所韩文欣主任药师鉴定为柴胡属植物黑柴胡(Bupleurum smithii Wolff)的干燥根。制备方法：将黑柴胡粉碎至粗粉状，按照料液比1：8加入75%乙醇，在75℃下回流提取3次，每次1 h，滤液合并后使用旋转蒸发仪减压浓缩至适宜体积，随后转至鼓风干燥箱中干燥至浸膏状，即得黑柴胡提取物(Extract of bupleurum smithii wolff, EOB)，给药时按照提取率换算成原药材量(1 g/kg剂量即为每公斤体重给药1g生药量)。脂多糖，用生理盐水配成5 μg/μL的溶液，临用前配制；盐酸多奈哌齐(批号20160510)，临用前研磨均匀并用生理盐水配成0.5 mg/mL的溶液；TNF-α、IL-1β试剂盒；其余常规试剂均为分析纯。

2 实验动物 雄性ICR小鼠72只，体质量20～22 g，由宁夏医科大学实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK(宁)2015-0001。饲养环境：动物同室分笼饲养，使用普通鼠饲料喂养，自由饮水，室温20℃～25℃，湿度40%～60%。

3 实验仪器 RE-2000A型旋转蒸发仪；SHB-B95A型真空泵；DHG-9140型鼓风干燥箱；WMT-100型Morris水迷宫系统；BW-NOD405型新物体识别实验箱；Bio-Rad 680型酶标仪。

4 实验方法

4.1 分组、造模与给药:72只ICR随机分为空白组、模型组、EOB低、中、高剂量组，阳性对照组，每组12只。空白组小鼠侧脑室注射生理盐水(3 μL/只)，模型组和药物治疗各组小鼠侧脑室注射等体积的LPS溶液(5 μg/μL，3 μL/只)建立AD模型。参照小鼠脑立体定位图谱，侧脑室注射位置在两眼连线中点偏右1 mm和后眼角连线后2 mm处，颅骨表面皮肤消毒处理后，将微量注射器垂直刺入颅骨表面2 mm，将LPS溶液注入侧脑室，留针3 min后取出[6]。造模后次日起，EOB低、中、高剂量组每天灌胃EOB 1 g/kg、2 g/kg、4 g/kg，阳性对照组小鼠每天灌胃多奈哌齐5 mg/kg，空白组、假手术组和模型组每天灌胃给予相同体积的生理盐水，均为1次/d，连续灌胃21 d。

4.2 Morris水迷宫实验：小鼠造模后14～17 d进行Morris水迷宫实验[7]。每天进行1次测试，连续测试3 d。水迷宫实验在直径120 cm、高50 cm的水池中进行。在水池上4个象限，每象限边缘的中心作水池的入水点。在第四象限的中心放入一圆平台，平台直径6 cm、高30 cm。实验前加水至水面高于平台1～2 cm，用染料将水染黑，控制水温在(21±1)℃。实验时，将小鼠依次从1-3象限面向水池壁放入水池中，让小鼠自由游泳寻找平台，同时记录小鼠找到平台所需的时间，即逃避潜伏期。小鼠爬上平台后，让小鼠在平台上停留30 s。若在60 s内未能找到平台，则人为将小鼠放置于平台上停留30 s。实验时保持环境安静，以减少外界干扰因素引起的实验误差。

4.3 新物体识别实验：啮齿类动物对新物体都有一定的探索本性，而认知功能损伤的动物对新物体的辨别能力下降，新物体识别实验正是利用这种特点设计的[8]。该实验在造模后第18～20天进行，用于评价动物对新物体的识别能力。实验在一方形白色不透明有机玻璃测试箱(50 cm × 50 cm × 30 cm)中进行，箱体上方放置摄像机，使用MGS-1分析软件跟踪记录动物的运动。整个测试为期3 d，分适应期、训练期和检测期。适应期将小鼠放入测试箱，让其自由活动3 min适应环境，然后将小鼠放回原来的饲养笼。训练期在测试箱中对称放入2个相同(形态，大小，规格一样)的物体(A1和A2)，测试物距测试箱壁约10 cm，彼此相距约25 cm。将小鼠从距离两个物体等距离处放入箱中自由探索3 min，如果小鼠的鼻子触及测试物或用鼻子在1 cm之内指向物体则被视为发生探索行为，记录小鼠在此阶段对两个测试物的总探索时间。5 min后进入检测期，用物体B(形状、大小、颜色与A完全不一样)替换物体A2，分别记录小鼠对新测试物和熟悉测试物的探索时间，计算新物体偏爱指数(新物体偏爱指数=小鼠对新测试物的探索时间/小鼠对熟悉测试物和新测试物的总探索时间)。测试结束后，用75%乙醇擦拭测试箱，以防止动物气味残留影响实验。

4.4 ELISA实验：造模后第21天，最后一次灌胃给药1 h后，将小鼠快速断头处死，取大脑海马组织配制成10%脑海马匀浆。按照试剂盒说明书进行操作，检测脑海马匀浆中TNF-α、IL-1β和ROS的含量。

5 统计学方法 采用SPSS 18.0软件对数据进行统计学分析。以均数±标准差表示。组间比较用Oneway ANOVA检验，P<0.05为有统计学意义。

结 果

1 EOB对AD小鼠NOR实验新物体偏爱指数的影响 如表1所示，侧脑室注射LPS后，模型组小鼠的新物体偏爱指数较空白组显著降低 (P< 0.01)；EOB高、中、低剂量组和阳性对照组小鼠的新物体偏爱指数均明显高于模型组(P< 0.05或P< 0.01)，表明黑柴胡提取物能够明显改善AD小鼠的新物体识别能力。

表1 黑柴胡提取物对AD小鼠NOR实验新物体偏爱指数的影响

注：与空白组相比△P<0.01; 与模型组相比，*P< 0.05, ▲P< 0.01

2 水迷宫实验逃避潜伏期的影响 如表2所示，随着训练时间的延长，各组小鼠的逃避潜伏期均有逐渐缩短的趋势。与假手术组相比，模型组小鼠第2～4天的逃避潜伏期明显延长(P<0.05)。与模型组相比，EOB低剂量组动物的逃避潜伏期有所减短，但没有统计学差异；EOB中剂量组第3～4天逃避潜伏期与模型组相比明显缩短(P<0.05)；而EOB高剂量组则从第2天开始逃避潜伏期即短于模型组(P<0.05)，结果表明黑柴胡提取物对LPS诱导的AD小鼠空间记忆损伤有明显改善作用。

3 EOB对AD小鼠海马组织中TNF-α、IL-1β和ROS含量的影响 如表3所示，与空白组相比，模型组小鼠脑内海马组织中TNF-α、IL-1β和ROS含量显著升高 (P< 0.01)；与模型组相比，不同剂量的EOB和阳性对照药多奈哌齐均可明显降低海马区TNF-α、IL-1β和ROS含量 (P< 0.05)；表明黑柴胡提取物可抑制LPS诱导的AD小鼠脑内海马区炎症因子的释放。

表2 黑柴胡提取物对AD小鼠水迷宫实验逃避潜伏期的影响

注：与空白组相比，#P<0.05,△P<0.01;与模型组相比，*P<0.05

表3 EOB对AD小鼠海马组织中TNF-α、IL-1β和ROS含量的影响

注：与空白组相比，△P<0.01; 与模型组相比*P<0.05, ▲P<0.01

讨 论

AD的发病机制尚不明确，目前主流的学说主要有Aβ沉积，Tau蛋白过度磷酸化、胆碱能系统障碍、慢性神经炎症等[9-10]。本研究主要从神经炎症角度，研究抗炎中药黑柴胡对LPS侧脑室注射诱导的AD模型小鼠的治疗作用。

LPS是经典的神经炎症诱导药物，通过侧脑室注射LPS可引起一系列炎症反应，促进IL-1β、TNF-α、ROS等炎症因子的释放，引起实验动物认知损伤。据此我们通过侧脑室注射LPS建立了AD神经炎症模型。本研究结果显示，EOB给药后可使小鼠逃避潜伏期明显缩短，新物体偏爱指数明显升高，提示黑柴胡提取物对LPS诱导的实验动物学习记忆功能损伤有明显的保护作用。TNF-α、IL-1β和ROS炎症细胞因子在AD发病过程中扮演了重要角色，它们一方面可以直接导致神经元的损伤和死亡，另一方面可以诱发神经元毒性级联反应，促进Aβ沉积，加剧活化的小胶质细胞引发的免疫反应，加快AD的病理进程。本研究发现，黑柴胡提取物可降低小鼠海马组织中TNF-α、IL-1β和ROS的含量，对神经炎症具有抑制作用。

综上所述，EOB能够明显缓解LPS诱导的AD小鼠学习记忆功能损伤，这一作用可能与其能够抑制脑内神经炎症反应有关。结果表明黑柴胡是一种有开发前景的抗AD中药，其活性成分和作用机制值得进一步研究。