破血化瘀汤治疗急性脑内血肿大鼠疗效及其对VEGF、GAP-43影响的研究*

周汉光，张建党，张元峰，曹阿丹

1.河南省南阳市中心医院神经外科(南阳 473000)，2.河南科技大学第二附属医院影像科 (洛阳 471000)

主题词 血肿 @破血化瘀汤 动物实验 大鼠

随着社会水平的提高和交通运输业的发展，外伤造成的颅脑损伤发生率仅次于四肢伤，在全身损伤中高达15%，其中以脑内血肿最为常见[1-2]。急性脑内血肿是指脑实质内的血肿，可发生在脑组织的任何部位，好发于额叶及颞叶前端，占总数的80%，其次是顶叶和枕叶约占10%左右，其余则分别位于脑深部、脑基底节、脑干及小脑内等处[3-5]。颅脑损伤后，血肿迅速形成，随着出血继续，血肿不断扩大，进而推移、压迫脑组织，导致颅内压升高和脑疝形成，从而引发一系列临床症状[6]。该病具有损伤部位严重、发病迅速、预后不良的特点。西医对脑出血的治疗主要采取保守的内科治疗，如脱水降颅内压，控制水肿，调整血压等，大剂量出血采取手术消除血肿，而中医药对本病在预防治疗和康复方面有良好的疗效与优势。中医理论中提出“离经之血便是瘀”一说，所以对急性脑出血提出了破血化瘀的治疗法则，临床上取得了较好的疗效，但是对其作用机制的研究尚缺乏理论支持，有必要进行实验研究。血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)是目前发现的刺激血管生成的因子之一，脑出血后血管再生是其治疗的关键所在，而VEGF是一种特异性作用于血管内皮细胞的多功能因子，其在急性脑出血恢复过程中发挥着重要作用[7]。生长相关蛋白-43(Growth associated protein,GAP-43)对神经的生长、发育、再生及突触功能的维持和神经递质的释放过程中发挥着重要的作用，是神经再塑、再生的分子标志物[8]。本实验主要是观察以破血化瘀的中药汤剂对急性脑内血肿大鼠的治疗效果及其对VEGF和GAP-43表达的影响。

材料与方法

1 材 料

1.2 试 剂：人VEGF ELSIA试剂盒；Re-vertaidTMFirst Strand cDNA Synthesis试剂盒；GIBCOTM M199培养基干粉，引物;AEC显色试剂盒；Ultra Sensitive TM S-P试剂盒; Boyden小室;鼠抗人VEGF、兔抗人VEG-FR2、AEC水性封片剂；recom-binant Taq酶(1U/μl)，dNTPs(10 mmol/L);3%戊巴比妥钠，4%多聚甲醛溶液，明胶，10%水合氯醛。

1.3 设 备：显微镜(日本，Olympus公司); 显微图像分析Motic Images 2000 1.3、数码成像系统; 凝胶成像系统及配套软件 Quantity One(美国，BIO-RAD公司)；PE9600基因扩增仪(美国，PE公司);全自动酶标仪(美国，BioTek公司);电泳仪(美国，BIO-RAD公司)；电冰箱。其他使用器械:静脉留置套管针、棉签、棉球、医用胶布、一次性医用橡胶手套、止血钳、弯钩钳、医用手术缝合针、玻璃分针、持针器、眼科剪、器械盘、手术刀、手术缝合线等。

1.4 动 物：SD大鼠，6周龄，体重(150±20) g，雌雄各半，SPF级，由辽宁中医药大学基础医学院动物实验中心提供。

2 方 法

2.1 动物模型的建立、分组及给药：采用随机数字表将大鼠，随机分为破血化瘀汤组和空白对照组，每组20只。两组以7 d连续灌胃给药形式，一组以15 g/kg破血化瘀汤剂量，另一组则给予等量生理盐水，2次/d，共14次，第8天注射3%戊巴比妥钠麻醉后，腹主动脉采血，静置、离心、灭活处理之后，分离血清，收集上层血浆，低温保存。

2.2 ELSIA检测VEGF含量：依照人VEGF ELSIA试剂盒说明书，吸取各组经药物处理48 h后的细胞培养上清液，进行检测。

2.3 免疫组化及PCR检测VEGF含量：将2 ml细胞悬液接种在置于10 cm2培养皿经预处理的盖玻片，取出经48 h后药物处理的盖玻片，经过磷酸缓冲液(PBS)清洗，固定10 min的中性甲醛，经过透膜处理20 min以后，采用常规免疫组化对照检测VEGF，选鼠抗人VEGF单克隆抗体为一抗，另一抗以PBS作阴性对照。应用Motic Images 2000 1.3采集图像及显微图像对VEGF免疫组化图片进行对照分析，蛋白的相对含量则采用平均灰度值来间接表示，与阳性反应产物成相反趋势，蛋白含量越少，阳性反应产物越深，平均灰度值越小。分别对5 d、10 d、15 d的各组大鼠进行免疫组织染色，经10%水合氯醛(3.5 ml/kg体重)腹腔注射、麻醉，灌注破血化瘀汤剂，取脑组织。用4%多聚甲醛溶液固定24 h，常规石蜡制作石蜡切片染色，将明显血肿切片选出，留用分析。对选出的切片进行室温脱蜡，在3% H2O2溶液中静置10 min，经过蒸馏水和磷酸缓冲液(PBS)冲洗6 min，再将切片浸于枸椽酸盐缓冲液(PH6)中，每隔10 min后微波修复 5 min。自然冷却至室温后，滴加一抗(GAP-43)，于4℃冰箱孵育12 h。切片由磷酸缓冲液(PBS)冲洗6 min，甩干后滴加相应二抗，于恒温箱(37℃)中孵育30 min，PBS再冲洗6 min。二氨基联苯胺法(DAB)显色5～10 min，注意控制染色深度，冲洗后，苏木素复染1～2 min，再冲洗，脱水封片。随机选取各时间点每组各标本于血肿区周围6个视野，采用高倍镜( ×400)进行观察， 再利用Motic 3000数码成像系统，计算平均每个视野内GAP-43的阳性细胞个数。每组GAP-43阳性蛋白细胞数以120个视野的平均值。

2.4 治疗效果评价：分别将3种不同浓度的破血化瘀汤剂组与同血清含量的空白对照对比，观察不同浓度的破血化瘀汤剂较同血清含量的空白对照组对VEGF水平的影响、对VEGF表达的影响、VEGF受体的影响；观察造模后的第5天、第10天、第15天破血化瘀汤组与空白组相比对大鼠脑组织GAP-43蛋白表达的影响。

结 果

1 破血化瘀汤剂对VEGF水平的影响 分别将3种不同浓度的破血化瘀汤剂组与同血清含量的空白对照组对比，从VEGF ELISA 检测结果(图1)发现，2.5%含药血清与2.5%空白对照组相比能显著提高血管内皮生长因子VEGF的含量(P<0.05)，说明该浓度的含药血清能够显著促进VEGF的分泌;而其余浓度的含药血清对VEGF的作用不是十分显著。

2 破血化瘀汤剂对VEGF表达的影响 Motic 3000处理免疫组化照片的图像分析结果(图1)显示，与同血清含量的空白对照相比，2.5%含药血清组的VEGF灰度值最小，表明该组细胞内VEGF相对含量最高，同时也能显著促进VEGF的合成(P<0.05)，另外两种药物浓度对VEGF的含量水平与合成均无显著影响。

3 破血化瘀汤剂对VEGF受体的影响 RT-PCR的检测结果(表2，图1)显示，分别将3种不同浓度的破血化瘀汤剂组与同血清含量的空白对照相比，2.5%含药血清与2.5%的空白对照组相比，血管内皮生长因子VEGF含量、及其受体的转录水平(P<0.05)二者都显著提高;而较高浓度5%含药血清与5%的空白对照组相比，5%含药血清对VEGF本身的转录有影响;而对VEGF及其受体的表达均无显著影响是较低浓度1.25%含药血清。

表1 破血化瘀汤对VEGF表达的影响

注：A-C依次为1.25%，2.5%，5%破血化瘀汤剂血清；D-F依次为1.25%，2.5%，5%空白血清

图1 RT-PCR 检测 VEGF mRNA 表达结果

4 破血化瘀汤剂对大鼠脑组织GAP-43蛋白表达的影响 高倍镜下大鼠脑组织GAP-43阳性细胞，颜色呈淡黄色或棕黄色，主要表达于血肿区神经元胞质中，胶质细胞仅有少量表达。造模后的第5天，各破血化瘀GAP-43均有表达，随时间增加表达也随之增加，在第10天后，开始有不同程度下降。与空白组相比，破血化瘀汤组第10天、15 天的GAP—43阳性细胞数显著增加，差异有统计学意义(P<0.05)。

表2 各时间点各组大鼠脑组织GAP-43阳性细胞数比较

讨 论

急性脑内血肿是指由于外伤导致颅内出血，随着出血加重，血肿迅速形成，并在72 h内造成颅内压升高或者脑疝形成[9-10]。脑内血肿常发生的部位大致在硬膜外、硬膜下及脑内三类，不同的损伤部位，患者的病情程度也不同。硬膜外血肿受损程度较轻，患者在昏迷之间伴随清醒；硬膜下血肿相对之下，昏迷发生快、昏迷时间持续长、颅内压突发升高，不易控制；脑内血肿患者的脑实质受损较为严重，由轻度昏迷转变深度昏迷，支配重要功能的部位易被血肿压迫，预后较差[11-14]。若临床恢复期除了采取一般的西医治疗以外，配合使用适宜的中药汤剂，对症治疗，能够尽快帮助患者预后恢复，早日返回日常生活当中。

本实验中VEGF ELISA 检测结果发现，2.5%含药血清与2.5%空白对照组相比能显著提高血管内皮生长因子VEGF的含量，说明该浓度的含药血清能够显著促进VEGF的分泌;而1.25%和5%的含药血清对VEGF的作用不是十分显著。而图像分析结果显示，与同血清含量的空白对照相比，2.5%含药血清组细胞内VEGF相对含量最高，能显著促进VEGF的合成，而另外两种药物浓度对VEGF的含量与合成均无显著影响。RT-PCR的检测结果显示2.5%含药血清与2.5%的空白对照组相比，血管内皮生长因子VEGF含量、及其受体的转录水平都显著提高;而较高浓度5%含药血清与5%的空白对照组相比，5%含药血清对VEGF本身的转录有影响，而对VEGF及其受体的表达均无显著影响是较低浓度1.25%含药血清。表明破血化瘀汤剂可以促进脑内血管内皮的生长因子VEGF，不同药物浓度对 VEGF的影响也不同，灌胃给药10 d后的正常大鼠，血清中VEGF含量明显升高，同时，仅2.5%浓度含药血清能显著促进VEGF的合成。

正常生理状态下，生长相关蛋白-43(Growth associated protein,GAP-43)处于低水平，而当脑神经损伤时, GAP-43表达的增高是内源性神经再生的显著特征[15]。因此, GAP-43可以用来标记神经元发育生长、神经再生以及成熟中枢神经系统中突触重建。故GAP-43高表达是在脑组织因缺血、缺氧，激活神经纤维发芽、突触重建的神经再生的过程[16]。实验中，GAP-43在脑血肿后第5天就开始表达，至第10天逐渐降低，表明破血化瘀汤剂可以有效提高脑血肿大鼠脑组织GAP-43阳性表达，并延缓其下降，从而促进脑缺血后神经的再生，增加中枢神经系统的修复能力。

总之，破血化瘀汤剂有助于促进急性脑内血肿血管内皮VEGF的生长以及利于大脑神经元神经GAP-43再生。