竹根七药材质量标准研究*

郭 琳，李玉泽，毛昭琦，热萨来提，宋小妹，崔九成，范少敏△

1.陕西中医药大学第二附属医院(咸阳 712000)，2.西北大学生命科学学院(西安710069)，3.陕西中医药大学(咸阳 712046)

主题词 中药学 竹根七 质量控制

竹根七为百合科开口箭属植物开口箭(Tupistra chinensis baker.)的根茎。生于海拔1000～2000m的林下阴湿处、溪边或路旁。分布于陕西、湖北、江西、福建、浙江等地，陕西以秦岭以南的平利、洛南、镇坪、眉县分布较多，全年可采。多作为民族或民间用药，性寒，味微苦、辛，具有清热解毒，祛风除湿，散瘀止痛等功效，用来治疗头痛咳嗽、咽喉肿痛，风湿关节痛和跌打损伤等病症[1-5]。现代研究表明甾体皂苷类为竹根七的主要化学成分[6]，竹根七提取物具有抗炎、抗肿瘤和抑菌等[7-12]药理作用，2015版《陕西省药材标准》收录的竹根七标准未采用高效液相法进行含量测定，在薄层鉴别中选取的对照品具有一定局限性，本文在对竹根七进行系统化学成分研究的基础上，从竹根七的植物形态、药材性状、显微特征、TLC 法鉴别、HPLC 法测定含量和指纹图谱等方面，建立竹根七药材的质量评价体系，为药材的质量规范和临床疗效保证提供科学依据。

材料与方法

1 材 料

1.1 药材:竹根七分别购于陕西汉中，陕西眉县红河谷，宝鸡凤县等地，经陕西中医药大学生药教研室王继涛高级实验师鉴定为百合科开口箭属植物开口箭Tupistra chiensis Baker.的干燥根及根茎。

1.2 仪器及试剂:高效液相色谱仪(Waters Alliance e2695，2998PDA检测器)(美国waters公司)；GB204电子天平(精密度0.1 mg)；HHS2I-8电热恒温水浴锅；舒美KQ-500DE型超声波清洗仪；K101-0ES型电热鼓风干燥箱；200-JRAB型高速万能粉碎机；显微镜DMBH200，微型计算机(型号：启天M430E；批号：P580A2717042)。乙腈为色谱纯; 其余均为分析纯; 水为娃哈哈纯净水; 对照品 Tupistroside E 为实验室自制, 经 HPLC 检验，纯度>98%，符合含量测定要求。

2 方 法

2.1 植物形态:其原植物开口箭为多年生草本。根状茎长，圆柱形，直径1～1.5 cm，多节，绿色至黄色。叶基生，4～12枚，近革质或纸质，倒披针形、条状披针形，长15～65 cm，宽1.5～9.5 cm，先端渐尖，基部渐狭，鞘叶2枚披针形或距圆形，长2.5～10 cm。穗状花序直立，少有弯曲，密生多花，2.5～9 cm；总花梗短，长1～6 cm；花短钟状，长5～7cm，花被筒长2-2.5 cm；裂片卵形，先端渐尖，长3～5 cm，宽约2～4 cm，肉质，黄色或黄绿色；花丝基部扩大，其扩大部分有的贴生于花被片上，有的彼此连合，花丝上部分离，长1～2 cm，内弯，花药卵形；子房近球形，直径2.5 mm，花柱不明显，柱头墩三棱形，顶端三裂。浆果球形，熟时紫红色，直径8～10 mm。花期7～8月，果期8～10月[3]。

2.2 性状:根茎扁圆柱形，略弯曲，长10-15 cm, 直径1-1.8 cm，节明显，略膨大，节处有芽及膜质鳞片状叶，节间短。表面黄棕色或黄绿色，有纵皱纹，节处有明显的环状皱纹，并散有圆点状的须根痕。质略硬，易折断，断面浅黄白色，细颗粒状。无臭，味微甘而苦涩。

2.3 显微特征:粉末：黄白色。淀粉粒稀少 ，单粒类圆形，脐点、层纹不明显，草酸钙针晶成束或散在。螺纹、梯纹导管多见，偶见网纹导管。残留基生叶表皮细胞长条形或长多角形，垂周壁连珠状增厚。

3 结 果

3.1 薄层色谱鉴别:精密称取竹根七粉末1.0 g，置于100 ml具塞锥形瓶中，然后加20 ml的60%甲醇水，加热回流提取1.5 h，滤液蒸干，残渣加水20 ml溶解,用水饱和正丁醇萃取3次后合并萃取液蒸干, 浸膏加入2 ml甲醇溶解,作为供试品溶液。另取邻苯二甲酸二丁酯和Tupistroside E 对照品，用甲醇溶解后，制成每1 ml含2.0 mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(附录Ⅵ B)实验,吸取上述溶液各3 μL，分别点于硅胶GF254 薄层板上，展开剂采用三氯甲烷∶甲醇∶水(7∶3∶1)下层液，取出晾干后喷10%硫酸乙醇溶液,在105℃加热至斑点显色清晰。供试品在与对照品色谱相应的位置上显示相同颜色的斑点，见图1。

注：A为254 nm波长下观察，B为日光下观察；1对照品邻苯二甲酸二丁酯，2红河谷，3汉中，4凤县，5 Tupistroside E供试品

图1 竹根七供试品及对照品薄层色谱

3.2 含量测定

3.2.1 色谱条件：依利特 Hypersil BDS C18(250 mm×4.6 mm，5 μm )色谱柱; 柱温30℃; 流速1 ml/min。流动相为乙腈( A)-水(B )梯度流动相, 检测波长203 nm;见表1。在该色谱条件下，Tupistroside E对照品保留时间约为21.87 min，3种产地供试品色谱Tupistroside E峰与杂峰分离良好。色谱图见图2。

3.2.2 对照品溶液和供试品溶液制备：精密称取Tupistroside E对照品5.7 mg，置于10 ml 量瓶中, 用甲醇溶解并定容至刻度，配制成含Tupistroside E 0.57 mg/ml的溶液，经0. 45 μm滤膜滤过，滤液作为对照品溶液。精密称取竹根七粉末约0.5 g，放入具塞锥形瓶中，加入10 ml的60%甲醇水,称重，超声1 h(功率 250 W，频率40 k Hz)后，再次称重，放冷并补足重量，用0.22 μm滤膜滤过，即得供试品溶液。

表1 梯度洗脱程序

图2 对照品(A)与供试品溶液(B)的色谱图

3.2.3 标准曲线的制备：分别精密吸取Tupistroside E对照品溶液5，10，15，20，25，30，40 μL，每体积进样3次，按上述色谱条件测定峰面积。横坐标为进样量质量(X, μg), 纵坐标为色谱峰面积( Y, AU ) ，进行线性回归。得对照品Tupistroside E的回归方程 Y=184190X+8090.2，r=0.9996，线性范围为2.85～ 23.00 μg。

3.2.4 精密度、稳定性和重复性试验：吸取标准品溶液10 μL进样，按照色谱条件,重复进样6次，测定Tupistroside E峰面积，RSD为1.01%，结果表明仪器精密度良好；精密吸取供试品溶液20 μL，分别在0，1, 2，4，8, 16, 24 h 进样分析, 照色谱条件测定色谱峰峰面积，结果Tupistroside E峰面积的RSD为0.63%，表明样品溶液在配制后24 h内稳定，取同一批次药材，平行称取6份，按方法制备供试品溶液, 照色谱条件测定Tupistroside E含量，结果表明本法重复性较好，RSD为1.17%。

3.2.5 加样回收试验：称取已知含量的样品9份，每份约0.25 g，精密称定，分别加入Tupistroside E对照品适量，制备供试品溶液, 照色谱条件测定Tupistroside E含量。计算回收率，结果见表2。样品含量测定：称取3种产地竹根七药材粉末各3 份(过4号筛，低温烘干至恒重)，每份约0.5 g，按照制备供试品溶液，精密吸取样品溶液15 μL，根据外标法计算不同产地竹根七(红河谷，汉中和凤县)中Tupistroside E的含量分别为3.078 %，3.010 % 和3.724 %(n=3)。

3.3 指纹图谱研究

3.3.1 竹根七药材样品来源：10 批竹根七药材编号S1 ～ S10，其中，S1 ～ S4 号采自陕西红河谷，S5 号采自陕西凤县，S6产自甘肃西山、S7 产自陕西汉中、S8 产自陕西太白、S9 产自四川、S10 产自陕西眉县，经陕西中医药大学生药教研室王继涛高级实验师鉴定为百合科开口箭属植物开口箭Tupisra chiensis Baker.的干燥根及根茎。

表2 加样回收率实验

3.3.2 供试品溶液制备：精密称取竹根七粉末(过5号筛)约0.5 g，置100 ml具塞锥形瓶中，精密加入甲醇20 ml，称重，超声处理(功率250 W，频率 60 kHz)45 min，放冷，称重，用甲醇补足重量，用0.22 μm 微孔滤膜过滤，作为供试品溶液，即得。

3.3.3 色谱条件：色谱柱为 Thermo HyPURITY C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；以乙腈(A相) 和水(B相)为流动相，梯度洗脱条件：0～25min, 15%→23%A, 25～30min, 23%→24%A,30～36min, 24%→24%A, 36～40min, 24%→28%A,40～55min, 28%→34%A,55～60min, 34%→40%A,60～64min, 40%→60%A,；柱温为25℃；检测波长为 203 nm；流速为1ml/min；进样量为10 μL。

3.3.4 精密度、重复性和稳定性试验：精密吸取同一样品的供试品溶液，连续进样6次，结果各共有峰与内参比峰相对保留时间的RSD均低于0.3%，相对峰面积的RSD均低于3.0%。 表明仪器精密度良好，符合指纹图谱的要求。取同一批药材样品6份，按供试品溶液制备方法制备供试品溶液，按项下色谱条件进行分析。结果各共有峰与内参比峰的相对保留时间的RSD均低于0.3%，相对峰面积的RSD均低于3.0%，表明方法重现性良好。 精密吸取同一样品的供试品溶液，分别在0、2、4、8、12、24 h 进样分析，结果各色谱峰相对保留时间的RSD均低于0.2%，相对峰面积的RSD均低于3.0%，符合指纹图谱的要求，且各时间点色谱图相似度均大于0.95，表明供试品溶液在24 h内基本稳定。

3.3.5 指纹图谱建立：取10批不同产地的竹根七药材样品，约0.5 g，精密称定，按“供试品溶液制备”项下方法制备供试品溶液，按“色谱条件”项下色谱条件进样测定，记录 10批竹根七药材的HPLC指纹图谱。将其导入国家药典委员会《中药色谱指纹图谱相似度评价体系2004A 版》软件进行分析，以陕西红河谷竹根七样品(S05)的指纹图谱为参照图谱，以平均数法生成对照图谱，时间窗宽度为0.2s，经多点校正、自动匹配后生成竹根七药材指纹图谱的共有模式R，并建立10批竹根七药材的指纹图谱，见图3。

3.3.6 相似度评价：按国家药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004A)”比较样品的色谱图和计算相对保留时间，对10批样品指纹图谱采用多点校正后进行自动匹生成对照图谱，见图4。计算10 批样品的相似度，结果见表3。由相似度结果可知，以上样品与对照谱相比较，除个别批次(如S5,S6,S9)外，其余相似度均达到0.88以上，药材差异较小。

图3 10批竹根七药材的指纹图谱图4 竹根七共有峰HPLC标准图谱

表3 10 批次样品相似度评价

讨 论

竹根七多年生草本，高25～50 cm。根茎连珠状，粗1～1.5 cm。叶互生，具柄；叶片纸质，卵形、椭圆形或长圆状披针形，长4～9 cm，宽2.3～4.5 cm，先端渐尖，基部钝、宽楔形或稍心形，两面无毛[13-16]。花1～2朵生于叶腋，白色，内带紫色，稍俯垂；花梗长7～14mm；花被钟形，长15～22 mm，花被筒长约为花被的2/5；副花冠裂片膜质，与花被裂互生，卵状披针形，长约5 mm，先端通常2-3齿或2浅裂；雌蕊长8～9 mm，花柱与子房近等长。浆果近球形，直径7～14 mm，具2～8颗种子。花期4-5月，果期11月。可用于治疗劳伤风湿疼痛，虚咳多汗，产后虚弱，腰痛遗精，夜尿频多等症。《陕西中草药》曰为除风湿，清热泻火，镇痛止血，调经活血，滋阴补虚。治风湿性关节炎，腰腿疼痛，跌打损伤，劳伤，月经不调，骨蒸劳热。

不同流动相的考察。为了最佳分离指标成分，分别用甲醇-水和乙腈-水等流动相体系进行洗脱，发现用乙腈-水洗脱基线平稳，分离度较高。最终发现采用乙腈-水体系，梯度(0～15 min, 15%～23% A; 15～33 min, 23%～38% A; 33～40 min, 38%～100% A; 40～45 min, 100%～100% A)洗脱，竹根七中主要成分甾体皂苷类化合物的色谱峰分离度最高。

液相检测波长的确定[17-19]。竹根七皂苷的结构类型主要为甾体皂苷，对不同的检测波长进行探索后发现该类化合物在紫外区末端有吸收，故本文选择检测波长λ=203 nm，在此色谱条件下，基线较为平稳，色谱峰峰型较好，而且色谱峰能达到基线分离。

采用薄层色谱有快速、简便等特点。在对实验条件的系统考查基础上确立了竹根七薄层色谱条件，考察了三氯甲烷- 甲醇- 水、三氯甲烷 - 甲醇、石油醚- 乙酸乙酯等不同比例的展开系统，且经反复证明，薄层色谱(三氯甲烷：甲醇：水 =7：3：1) 下层液为展开剂展开，具有分离度高、斑点清晰、简便易行等特点，可用于竹根七药材的鉴别。3种产地竹根七中Tupistroside E含量测定结果来看，不同产地竹根七中Tupistroside E的含量有一定差异，其中陕西凤县最高，红河谷其次，汉中最低。本实验为其他成分的含量测定方法提供了参考。竹根七作为秦巴山区的道地药材，是陕西“太白七药”之一，被2015版《陕西省药材标准》收录，但它未采用高效液相法进行含量测定，在薄层鉴别中选取的对照品具有一定局限性，本课题组在系统研究竹根七化学成分基础上，对竹根七的质量标准进行了升级。该方法简便快速，分离度好，重现性好，准确度高，专属性强，此次薄层鉴别及高效液相含量测定方法可为竹根七质量标准的制定提供强大依据。