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淫羊藿苷联合冰片对脑缺血-再灌注损伤模型大鼠抗氧化活性、炎症反应和血脑屏障通透性影响*

2018-11-30胡江平邵新然孙晓冬蔡克瑞

陕西中医 2018年12期
关键词:淫羊藿苷冰片

闫 磊,胡江平,邵新然,孙晓冬,蔡克瑞

黑龙江省牡丹江医学院(牡丹江157011)

主题词 脑缺血/中西医结合疗法 淫羊藿苷 冰片

缺血性脑血管病是危害人类生命和健康的常见病,脑缺血-再灌注是其重要的病理生理阶段。脑缺血后出现的神经损伤、炎症反应和继发性损伤逐渐引起重视。淫羊藿具有温阳补肾、强筋健骨、祛风除湿等功效,淫羊藿苷是淫羊藿中的主要活性成分。淫羊藿苷具有改善内分泌、抗肿瘤和调节心脑血管功能等多重药理学作用[1]。冰片辛苦、微寒、性凉,是中医药中一味常用佐药,具有与其他药物配伍后促进其他药物透过生物屏障的作用[2-3]。本实验通过建立大鼠脑缺血再灌注模型,探索淫羊藿苷配伍冰片对脑缺血-再灌注损伤模型大鼠抗氧化活性、炎症反应和血脑屏障通透性的作用及其机制。

材料与方法

1 材 料

1.1 动 物:SPF 级大鼠50只,质量300~400 g,由牡丹江医学院实验动物中心提供。动物许可证号:SYXK(黑)2015-007。

1.2 试剂与仪器:淫羊藿苷购自陕西西安飞达生物技术有限公司,冰片购自国药集团化学试剂有限公司,髓过氧化物酶(MPO) 检测试剂盒、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、酶联免疫吸附测定(ELISA) 试剂盒(上海信帆生物技术公司),超氧化物歧化酶(SOD)活性检测试剂盒(南京建成生物工程研究所),伊文思蓝(EB) 染料(上海翊圣生物技术有限公司);酶标仪(美国BioTek公司),台式高速离心机(德国SIGMA公司),高效液相色谱仪(美国安捷伦公司)。

2 方 法

2.1 实验动物分组:按照随机表法将大鼠分成假手术组、模型对照组、淫羊藿苷组、冰片组和淫羊藿苷配伍冰片组,每组10只。术前给药7 d ,冰片组10%冰片石蜡油2 ml灌胃,含冰片量0.5 g/kg,每天1次;假手术组和模型对照组给予相同体积0.9%氯化钠注射液;淫羊藿苷组腹腔注射淫羊藿苷(80 mg/kg)2 ml,每天1次;淫羊藿苷配伍冰片组同时给予10%冰片石蜡油2 ml灌胃和腹腔注射淫羊藿苷(80 mg/kg)2 ml处理。

2.2 脑缺血再灌注模型的制备:脑缺血模型采用双侧颈总动脉夹闭法制备。大鼠术前禁水4 h,禁食12 h,采用10%水合氯醛( 300 mg/kg ) 腹腔注射麻醉。颈部正中切口后暴露、钝性分离左侧颈总和颈内、外动脉并结扎颈外动脉。假手术组仅剥离左侧颈总动脉,但不夹闭颈总动脉;其余四组夹闭颈总动脉0.5 h后撤掉动脉夹,恢复血流,缝合。大鼠术后均在同等条件下正常饲养,24 h 后处死大鼠,并提取脑组织标本。

2.3 脑组织SOD活性测定:脑缺血再灌注24 h 后迅速断头处死大鼠,提取缺血侧大鼠大脑额顶叶皮层组织,用生理盐水制成10%匀浆后按SOD试剂盒说明书进行操作并采用考马斯亮蓝法测蛋白质含量。

2.4 脑组织MPO 活性测定:脑缺血再灌注24 h 后迅速断头处死大鼠,提取缺血侧大鼠大脑额顶叶皮层组织,用生理盐水制成10%匀浆后按MPO 试剂盒说明书进行操作并采用考马斯亮蓝法测蛋白质含量。

2.5 测定脑组织EB含量:脑缺血再灌注24 h 后,经舌下静脉注射2% EB 溶液1 ml。1 h后迅速断头处死大鼠,提取缺血侧大鼠大脑额顶叶皮层组织,将缺血侧大脑组织用生理盐水制成匀浆并用50%三氯醋酸混匀,24 h后在620 nm处测定吸光度并计算脑组织中EB 含量。

2.6 测定脑组织TNF-α含量:脑缺血再灌注24 h 后迅速断头处死大鼠,提取缺血侧大鼠大脑额顶叶皮层组织,用生理盐水制成10%匀浆后,按ELISA 检测试剂盒说明书步骤操作测定TNF-α的表达。

结 果

1 淫羊藿苷、冰片对大鼠脑组织SOD活性的影响 脑缺血-再灌注24 h 后,假手术组、模型对照组、淫羊藿苷组、冰片组和淫羊藿苷配伍冰片组的大鼠脑组织SOD活性值,与模型对照组比较,淫羊藿苷组、冰片组和淫羊藿苷配伍冰片组大鼠脑组织SOD活性明显增高,其中以淫羊藿苷配伍冰片组作用最明显,差异有统计学意义(P<0.01)。

2 淫羊藿苷、冰片对大鼠脑组织MPO活性的影响 脑缺血-再灌注24 h 后,假手术组、模型对照组、淫羊藿苷组、冰片组和淫羊藿苷配伍冰片组的大鼠脑组织MPO活性值,模型对照组与假手术组比较,差异有统计学意义(P<0.01)。与模型对照组比较,淫羊藿苷组、冰片组和淫羊藿苷配伍冰片组大鼠脑组织MPO活性明显降低,其中以淫羊藿苷配伍冰片组作用最明显,差异有统计学意义(P<0.01)。见表1。

3 淫羊藿苷、冰片对大鼠脑组织TNF-α含量的影响 脑缺血-再灌注24 h 后,假手术组、模型对照组、淫羊藿苷组、冰片组和淫羊藿苷配伍冰片组的大鼠脑组织TNF-α含量,模型对照组与假手术组比较,差异有统计学意义(P<0.01),与模型对照组比较,淫羊藿苷组、冰片组和淫羊藿苷配伍冰片组大鼠脑组织TNF-α含量明显降低,其中以淫羊藿苷配伍冰片组作用最明显,差异有统计学意义(P<0.01)。见表2。

表1 五组大鼠脑组织SOD活性和MPO活性的比较

4 淫羊藿苷、冰片对大鼠脑组织EB含量的影响 脑缺血-再灌注24 h 后,假手术组、模型对照组、淫羊藿苷组、冰片组和淫羊藿苷配伍冰片组的大鼠脑组织EB含量,模型对照组与假手术组比较,差异有统计学意义(P<0.01)。与模型对照组比较,淫羊藿苷组、冰片组和淫羊藿苷配伍冰片组大鼠脑组织EB含量含量明显降低,其中以淫羊藿苷配伍冰片组作用最明显,差异有统计学意义(P<0.01),见表2。

表2 五组大鼠脑组织TNF-α含量和EB含量的比较

讨 论

脑缺血再灌注损伤是在脑缺血基础上再灌注导致的脑组织进一步损伤,最终会导致神经细胞坏死或凋亡,其机制尚未完全明确。目前的研究表明,脑缺血再灌注损伤主要与氧自由基损伤、炎症反应、兴奋性氨基酸、细胞内钙超载和细胞凋亡等几个方面有关[4]。缺血组织再灌注后,氧自由基可以引起微血管和实质器官的损伤;血脑屏障开放程度的增加可以导致脑水肿的加重,而炎症反应和炎症因子的释放可以通过加大血脑屏障开放的程度从而进一步加重脑水肿。因此,如何对抗氧自由基损伤、减轻炎症反应和降低血脑屏障的开放程度已经成为防治脑缺血再灌注损伤研究的热点。

淫羊藿属于小檗科淫羊藿属植物,《神农本草经》中首次记载了淫羊藿具有强筋骨、滋补肾阳、祛风湿等功效,药材来源为小檗科植物淫羊藿、箭叶淫羊藿、柔毛淫羊藿或朝鲜淫羊藿干燥叶入药,味辛、甘,性温。到目前为止,淫羊藿中已被分离鉴定的单体化合物超过260 余种,主要为黄酮类化合物,其中以淫羊藿苷含量最高。淫羊藿苷是传统中药淫羊藿的有效药理成分,是一类很有应用前景的中药单体。有研究发现淫羊藿苷能够上调神经生长因子的表达,诱导神经干细胞的增殖和神经元分化、营养神经细胞,改善记忆功能,调节心脑血管功能的作用,因此淫羊藿苷在抗神经损伤领域有广阔的研究前景[5]。但是其是否能在脑缺血-再灌注损伤中起到神经保护作用及机制尚未得到阐述。血脑屏障由大脑微血管系统中无窗孔的毛细血管内皮细胞、星形胶质细胞和周细胞构成。血脑屏障允许血液循环中脑组织所需的营养物质进入脑内,而对脑组织有害的化学物质、大分子物质和大部分药物均不能进入脑内,是保持大脑内环境稳定的重要结构基础。冰片属于小分子脂溶性单萜类化合物,系龙脑香科植物龙脑香树脂的加工品,具有抗炎镇痛、抗菌、抗病毒、保护心脑、双向调节神经系统、开窍醒神、抗惊厥、提高其他药物生物利用率、透过血脑屏障等作用[2-3]。冰片为芳香开窍药凉开之代表药,始载于《新修本草》,明代医家李时珍《本草纲目》记载冰片具通诸窍,散郁火之功。《本草衍义》认为其作用特点为独行则势弱, 佐使则有功,自古就应用在中药配伍中治疗疾病。冰片不仅自身能够透过血脑屏障,而且还能改变血脑屏障的通透性,促进其他药物透过血脑屏障,提高其他药物在脑内的浓度增加其治疗效果。将淫羊藿苷配伍冰片是否能在脑缺血-再灌注损伤中起到神经功能保护作用尚未见相关报道。

SOD是机体内清除自由基的重要抗氧化酶,SOD在全身各组织广泛分布,SOD可以与O2-反应形成H2O2,H2O2经过过氧化物酶的催化生成水从而清除自由基保护细胞免受氧化性伤害。SOD活性代表着机体清除氧自由基、抗氧化能力的强弱[6-7]。有学者发现在脑缺血再灌注模型中增加SOD活性后,脑缺血再灌注引起的组织损伤得以有效减轻[6-7]。本实验发现淫羊藿苷配伍冰片在脑缺血再灌注损伤模型中可以起到上调大鼠脑组织SOD活性的作用,通过其增加机体清除氧自由基、抗氧化的能力,起到神经保护作用。MPO是由中性粒细胞、单核细胞和某些组织的巨噬细胞分泌的含血红素辅基的血红素蛋白酶,是血红素过氧化物酶超家族成员之一,是中性粒细胞的特异性标志物,中性粒细胞炎症反应水平可由MPO活性反映[8]。本实验发现淫羊藿苷配伍冰片可以有效降低脑缺血再灌注损伤模型大鼠脑组织MPO 活性,提示淫羊藿苷配伍冰片可有效减轻脑缺血再灌注损伤导致的炎症反应程度起到神经保护作用。炎症反应在脑缺血再灌注损伤中发挥了重要作用,TNF-a是主要的促炎因子之一[9-10]。在神经系统中,TNF-α主要由星形胶质细胞、小胶质细胞、巨噬细胞和神经元产生[11-13]。在脑缺血再灌注损伤的过程中,脑缺血早期即可出现TNF-α表达水平的增高,TNF-α可以激活其它炎性因子表达,例如IL-1β、IL-1、IL-6、IL-10和IL-17等,从而增加炎症级联反应,加重神经元的凋亡和脑水肿的程度进而导致脑缺血再灌注损伤进一步加重[14-18]。本实验发现淫羊藿苷配伍冰片可以通过降低TNF-α的表达水平来抑制炎症反应程度从而减轻脑缺血再灌注损伤。在神经系统的相关研究中经常把EB作为评估血脑屏障损伤定性指标。EB在正常情况下无法通过血脑屏障,当血脑屏障被破坏后,EB可以进入脑组织,通过测定脑组织中EB的含量从而反映出血脑屏障损伤的程度。本实验发现,淫羊藿苷配伍冰片可以有效降低缺血脑组织EB的含量,提示淫羊藿苷配伍冰片可以降低脑缺血再灌注模型大鼠血脑屏障损伤的程度,减少炎性细胞、炎性因子和相关细胞因子进入脑组织,减轻脑缺血再灌注损伤起到神经保护作用。

综上所述,本实验通过建立大鼠脑缺血-再灌注模型,发现淫羊藿苷配伍冰片可以增加SOD活性,降低MPO 活性,降低TNF-α含量和降低血脑屏障的损伤程度,对脑缺血再灌注损伤模型大鼠的脑组织起到神经保护作用。

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