遗传物质的发现过程及其启示

王 颖

(人民教育出版社生物室 北京 100081)

肺炎链球菌是一种革兰氏阳性菌，能引起人的肺炎和呼吸系统的其他疾病。1881年，美国的乔治·斯滕伯格(George Sternberg)和法国的路易斯·巴斯德(Louis Pasteur)分别分离得到这种细菌，最初它被命名为Pneumococcus。1920年改称肺炎双球菌(Diplococcuspneumoniae)。因为它与链球菌非常相似，1974年被正式命名为肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)。这种菌对小鼠也具有极大的杀伤力，会导致小鼠死亡。

1 格里菲思实验

1923年，英国卫生部病理实验室的弗雷德里克·格里菲思(Frederick Griffith， 1879—1941)发现肺炎链球菌的菌落有两种类型： 一种是光滑的圆顶形，形态较为规则，这种菌有荚膜，能引起小鼠死亡，被称为光滑型(Smooth，S型)；另一种菌落为颗粒状、不规则，这种菌无荚膜，是减毒的，不会导致小鼠死亡，被称为粗糙型(Rough，R型)。格里菲思发现S型菌(以下简称S菌)经传代培养可以转变为R型菌(以下简称R菌)。当时已经发现的肺炎链球菌根据荚膜多糖的不同可分为Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型等。每种类型的肺炎链球菌都有光滑品系S菌和粗糙品系R菌[1]。

格里菲思将不同类型的活的R菌分别与加热致死的S菌同时注入小鼠体内，观察小鼠的存活，并从小鼠体内分离和鉴定肺炎链球菌。在他的一组实验中，将活的Ⅰ型R菌和加热致死的Ⅱ型S菌同时注入小鼠体内，几天后小鼠死亡，从小鼠体内分离出活的Ⅱ型S菌。这种转化不仅是同型的R菌转化为S菌，还有Ⅰ型转化为Ⅱ型[2]。

是什么原因导致Ⅰ型的R菌转化为Ⅱ型的S菌呢？新产生的Ⅱ型S菌的荚膜多糖来自哪里？格里菲思于1928年发表论文介绍了上述实验并作出解释： 死亡的小鼠体内(受体细胞)保留了合成Ⅱ型S菌荚膜多糖的物质，它能够促使Ⅰ型R型活细菌转化为Ⅱ型S型活细菌[2]。格里菲思没有意识到，将R菌转化为S菌的是加热致死的S菌中的活性物质，即后人所说的“转化因子”，他没有继续探索遗传物质的本质。后来，格里菲思不幸死于1941年德国对伦敦发动的一场轰炸中[3]。

2 艾弗里及其合作者的实验

在格里菲思发表论文两年后的1930年，美国洛克菲勒研究所奥斯瓦尔德·艾弗里(Oswald Avery， 1877—1955)实验室的亨利·道森(Henry Dawson)和理查德·夏(Richard Sia)实现了肺炎链球菌的离体转化实验。他们在含有抗R血清和加热致死的S菌的液体培养基中培养R菌，结果产生了活的S菌[4]。后来，艾弗里实验室的詹姆斯·阿洛韦(James Alloway)将S菌过滤，除去一些细胞组分，得到一种无细胞的提取液，并用提取液进行体外转化实验获得成功[5]。1934年，科林·麦克劳德(Colin MacLeod， 1909—1972)加入了艾弗里实验室，他同艾弗里一起用阿洛韦的体外系统进行转化实验。1941年，他们已经很有信心地认为转化因子是“胸腺类的核酸”[1]。1943年3月，艾弗里首先在洛克菲勒理事会上介绍了他们的实验过程和结果，并于1944年发表了这个经典的实验。

他们将S菌用去氧胆酸盐溶液漂洗数次，用乙醇沉淀，得到黏性的乳白色沉淀。将沉淀溶于盐溶液，然后用氯仿抽提2～3次除去蛋白，再用乙醇沉淀。将沉淀溶于盐溶液，加入能够水解多糖的酶，37℃消化4～6 h后鉴定溶液中的多糖已除去。再用氯仿抽提1次除去水解糖的酶和残留蛋白，然后用乙醇沉淀。他们就这样从75 L培养物中得到10～25 mg沉淀，然后将沉淀溶于盐溶液制成细胞提取物。他们首先用Ⅲ型S菌的细胞提取物与活的Ⅱ型R菌混合进行转化实验，并获得成功。接着，将细胞提取物用不同的酶进行处理后，再与活的Ⅱ型R菌混合进行转化。具体分这样几组： ①细胞提取物用蛋白酶处理，结果能够转化；②细胞提取物用RNA酶处理，能够转化；③细胞提取物用DNA酶处理，不能转化；④细胞提取物用脂酶处理，能够转化[6]。只有DNA酶能够阻止转化实验，这表明被DNA酶消化分解的DNA极可能就是细胞提取物中有活性的“转化因子”。接下来，他们分析了“转化因子”的理化特征： 转化因子的分子量很大，分子氮磷比约为1.67，在260nm的紫外线照射时具有最大的吸收峰值，检测DNA的二苯胺反应结果呈强阳性，检测RNA的苔黑酚检测结果是弱阳性，两种检测蛋白质的方法结果都是阴性，等等。这些理化特征或测试反应的结果都与DNA的极为相似。

艾弗里在论文的结尾处写道：“本文提出的证据支持以下观点： 脱氧核糖类型的核酸是肺炎链球菌Ⅲ型转化因子的基本单位。”艾弗里根据这些实验证据得出上述结论已经有足够的说服力，但是当时科学界普遍认为蛋白质才是遗传物质，因此艾弗里在论文中也曾十分谨慎地说：“当然也有可能，这种物质的生物学活性并不是核酸的一种遗传特性，而是由于某些微量的其他物质所造成的，这些微量物质或者吸附在它上面，或者与它密切结合在一起，因此检测不出来[6]。”

3 艾弗里的结论引发质疑

艾弗里的论文一经发表就引发质疑，质疑点主要是： 转化因子究竟是DNA还是和DNA混在一起的少量蛋白质。这些质疑既与“细胞提取物不够纯”的实际情况有关，还与当时科学界对DNA和蛋白质已形成的共识密不可分。

20世纪初，科学家已经知道核酸是由许多核苷酸单元聚合而成的化合物。德国生化学家卡尔·科赛尔(Karl Kossel， 1853—1927)发现核酸由碱基、磷酸和糖组成，并探明了组成核苷酸的四种碱基。1909年，美国生化学家费伯斯·列文(Phoebus Levene， 1869—1940)提出了核苷酸的概念、核苷酸是核酸的基本组成单位。他明确将核酸细分为核糖核酸(RNA)和脱氧核糖核酸(DNA)，并提出四核苷酸假说： 四个互不相同的核苷酸连接构成四核苷酸，四核苷酸连接组成DNA分子。这个假说认为DNA链是单调重复的分子[7]。这可能是因为列文在分析DNA结构时采用了剧烈的提取方法，破坏了DNA的结构，导致他将DNA视作分子量很小(1500 D)的分子[8]。当时“四核苷酸假说”深入人心，并促进了蛋白质的研究。进入20世纪，12种基本氨基酸已被发现，到1940年，其他8种基本氨基酸也一一被揭示。很多科学家认为以20种氨基酸为基本单位的蛋白质似乎含有无数复杂且不重复的遗传信息。而艾弗里实验中的细胞提取物含有微量的蛋白质，因此，他们就不接受艾弗里的实验结论。

持怀疑态度的还有“噬菌体小组”的多位成员。该小组的核心人物是马克斯·德尔布吕克(Max Delbrück， 1906—1981)、萨尔瓦多·卢里亚(Salvador Luria， 1912—1991)和阿尔弗雷德·赫尔希(Alfred Hershey， 1908—1997)[9]。许多取得杰出成就的科学家都出自这个小组，如詹姆斯·沃森(James Watson， 1928— )、马修·梅塞尔森(Matthew Meselson， 1930— )、富兰克林·斯塔尔(Franklin Stahl， 1929— )等。当时，德尔布吕克和噬菌体小组的大多数成员相信四核苷酸假说，因此并不相信艾弗里的结论。他们认为DNA只是一种单调乏味的大分子，怎么可能是遗传物质的载体呢？

反对艾弗里的还包括他的同事、核酸研究权威阿尔弗雷德·米尔斯基(Alfred Mirsky， 1900—1974)。米尔斯基尝试从多种生物材料中提取核酸和蛋白质。1946年，他从Ⅲ型肺炎链球菌中提取了核酸和蛋白质，并重复了艾弗里的实验，但是因为很难获得不含蛋白质的纯DNA，因此选择质疑艾弗里。1949年，米尔斯基发现同种生物不同细胞中的DNA含量相同，体细胞DNA含量是精子含量的两倍。这个结论本可以支持DNA是遗传物质，但他仍然不相信仅靠DNA就会携带遗传信息。

4 更多研究让人们确信DNA就是遗传物质

面对争议，艾弗里的研究团队细化实验，进一步加强实验证据。他们采取的方法有： ①优化提取转化因子的方法，提高转化因子的种类、产量和纯度，将蛋白质最大污染量降至0.02%；②纯化DNA酶，1944年他们在实验中使用的DNA酶并非纯化的DNA酶，1946年，麦卡蒂从牛胰中纯化DNA酶，并在转化实验中稀释该DNA酶，致使无法检测到蛋白水解酶活性[10]。

也有科学家利用其他实验材料取得了与艾弗里等人相同的结果。1945年11月，法国的安德烈·博伊文(André Boivin)宣布： 他成功地实现了大肠杆菌的转化。他们用从S2型的S菌(大肠杆菌)提取到的核酸去培养S3型的R菌，结果获得了S2型的S菌。而且，他们也能使S3型转化为S1型[1]。

其他科学家的发现则彻底否定了四核苷酸假说。首先，1934年卡斯珀森(Torbjörn Caspersson)用过滤的方法得到核酸，他推测核酸是比蛋白质还要大的大分子。1938年，卡斯珀森与席格纳(Rudolf Signer)合作得到了分子量为50万、100万道尔顿的DNA分子。这就排除了“DNA是一个小分子”的反对意见。其次，美国生化学家埃尔文·查哥夫(Erwin Chargaff， 1905—2002)发现： 不同生物DNA中四种碱基的比例并不一致，但是腺嘌呤(A)总是与胸腺嘧啶(T)含量一致，鸟嘌呤(G)总是与胞嘧啶(C)一致[11]。这个发现彻底否定了四核苷酸假说，为人们接受DNA是遗传物质扫清了障碍。

后来，赫尔希和蔡斯(Martha Chase， 1927—2003)的噬菌体侵染实验再次证明DNA是遗传物质。他们发现，在噬菌体感染未被同位素标记的大肠杆菌后，35S的蛋白质外壳留在细菌外面，而32P的DNA则出现在细菌内部。如果让噬菌体与细胞碎片混合，35S就吸附于细胞的碎片上，溶液中则出现了32P的DNA。接着，他们用32P或35S标记的T2噬菌体分别感染大肠杆菌，经过短时间的温育，再用搅拌器搅拌(使吸附在细菌上的噬菌体与细菌分离)、离心(让上清液中析出重量较轻的T2噬菌体颗粒)。离心管的沉淀物中留下被感染的大肠杆菌。离心后，检查上清液和沉淀物中的放射性物质发现： 用35S标记的一组感染实验，放射性同位素主要分布在上清液中，子代噬菌体几乎都不含35S；用32P标记的一组实验，放射性的同位素主要分布在试管的沉淀物中，约有30%的32P出现在子代噬菌体中[12]。当这个结果公布后，起初质疑艾弗里的噬菌体小组则一下子接受了这个结论。1953年，赫尔希-蔡斯实验与DNA双螺旋结构模型同时在冷泉港的学术会议上展示，这也使得前者变得引人注目，科学家自此普遍接受DNA是遗传物质。

5 正确理解艾弗里实验的价值，厘清三个重要实验的关系

作为发现遗传物质本质的第一人，艾弗里的研究结论长期不被接受。在介绍分子生物学历史的早期著作中，赫尔希-蔡斯实验被视为证明DNA是遗传物质的唯一实验。事实上，艾弗里是人类第一次用确凿的实验证据说明遗传物质的本质，揭示了DNA的重要性。查哥夫正是知道了艾弗里的研究结论后，才转而研究DNA。而沃森和克里克正是知道了查哥夫法则，才对搭建的模型进行调整从而解析了DNA双螺旋结构。因此，艾弗里的卓越贡献不容忽视。

格里菲思实验是艾弗里等人探究遗传物质本质的基础。格里菲思利用肺炎链球菌做转化实验，开辟了用细菌研究遗传的新领域，并取得重要结论。而艾弗里的一系列研究是对格里菲思实验的延伸，并取得了里程碑式的结论，第一次证明DNA是遗传物质。赫尔希-蔡斯实验则是对艾弗里实验结论的进一步支持，他们利用噬菌体作为研究材料，巧妙设计实验，显示出杰出科学家的品质和能力，但是研究的目的追随了艾弗里。

6 遗传物质的研究过程反映了科学的本质

科学不仅表现为系统化的知识体系，而且还包含有独特的科学方法和科学精神[13]。毫无疑问，对遗传物质的探索就是科学发展的过程，对这段历史的梳理有助于理解科学的本质。

科学之路充满了观点的碰撞和论争。科学是一种不断发展和自我矫正的探究过程。从1923年格里菲思开始研究肺炎链球菌，历经近30年，人们才确信DNA是遗传物质。过程虽然曲折，但人类最终探明了遗传物质的本质。这充分反映出世界是可以被认知的，科学知识并非绝对真理，而是在不断的修正中完善的；反映出科学知识所具有的可认识性、开放性、可重复性、累积性等。

科学方法和理性思维在科学发现中具有重要作用。科学知识是科学家基于证据、运用科学方法、经过巧妙的实验设计和严密的逻辑推理获得的。对遗传物质的探索，科学家充分运用了多种科学方法，展示出他们的理性思维。首先，科学家都采用了实验法来获取事实和证据，实验方法有： 肺炎链球菌的体内转化实验体系、体外转化实验体系(该体系简化了实验过程、为鉴定转化因子打下基础)、微生物培养技术、同位素标记技术、噬菌体技术等。而且，以细菌、病毒作为研究模型，充分利用实验对象材料简单、生长周期短、方便操作等优点。其次，在实验设计上，艾弗里从混合物中有选择地除去一种物质，通过观察转化活性，确定这种物质是否起作用，这其实是一种“排除法”。噬菌体侵染实验则是设法将DNA和蛋白质分开，实际也是“排除法”。由此可见，他们的研究对象不同，实验方法不同，但基于相似的思维方法，得出了同样的实验结论。

呈现了科学家质疑、求真、实证等科学精神。科学注重证据和基于证据的逻辑推理。在遗传物质的发现过程中，基于重要实验所得到的结论都充分体现了“证据”的作用。艾弗里等人最初制备的粗提物中含有少量蛋白质污染，但他们一直设法提高粗提物和酶的纯度，这也是试图获得更可靠的证据。这些都反映出科学家的实证、探索、求真的科学精神。