GMFG蛋白在宫颈癌中的表达及其与EMT的相关性

魏 星,冀 静,赵永林

(1西安交通大学第二附属医院妇产科,西安 710004;2西安交通大学第一附属医院妇产科;3西安交通大学第二附属医院肿瘤科;*通讯作者,E-mail:zhaoyonglinlin@163.com)

宫颈癌是全球范围内女性最常见的生殖系统恶性肿瘤,也是发病率第一的女性生殖系统恶性肿瘤[1]。根据我国2015年的癌症统计报告,每10万名女性中会有98.9名被诊断为宫颈癌,其中会有约30.5人死于此病[2]。高危型人乳头瘤病毒(human papilloma virus,HPV)的持续感染是宫颈癌的触发因素,但是癌症的发生和进展受多因素、多通路的调控参与,具体机制仍有待进一步探索,致癌机制研究成果的不断明确利于从预防到治疗的全方位科技转化,对精准预防宫颈癌奠定理论基础。

神经胶质成熟因子γ(glia maturation factor-γ,GMFG)是神经胶质成熟因子家族成员之一,在真核细胞及哺乳动物中高度保守。有研究表明GMFs属于动蛋白解聚因子/切丝蛋白(actin depolymerizing factor/cofilin,ADF/cofilin)超家族成员,在细胞骨架调节中有着重要的作用,参与细胞运动[3,4]。已有研究发现在浆液性卵巢癌和胰腺癌组织中其表达升高[5-8],其细胞运动能力和迁移能力显著增强,提示GMFG与肿瘤细胞的运动有密切关系。

上皮-间质转化(epithelial-mensenchymal transition,EMT)是上皮细胞通过特定程序转化为具有间质表型细胞的生物学过程。在胚胎发育、慢性炎症、组织重建、癌症转移和多种纤维化疾病中发挥了重要作用,其主要特征包括细胞黏附分子(如E-Cadherin)表达减少、细胞角蛋白细胞骨架转化为波形蛋白(Vimentin)为主的细胞骨架及形态上具有间充质细胞的特征等。通过EMT的过程，上皮细胞失去了细胞极性，失去与基底膜的连接等上皮表型，获得了较高的迁移与侵袭、抗凋亡和降解细胞外基质的能力等间质表型，是上皮细胞来源的恶性肿瘤细胞获得迁移和侵袭能力的重要生物学过程[9-11]。

目前国内外尚无GMFG在宫颈癌中的相关研究,本研究拟通过研究宫颈鳞癌中GMFG及EMT关键蛋白的表达,并探索二者之间的相关性,为宫颈癌发生和进展的机制研究提供一定的实验依据。

1 材料与方法

1.1 标本收集

所有组织标本均来自2012-01～2013-06西安交通大学医学院第一附属医院妇产科住院患者。30例临床分期Ⅰ-Ⅱ期宫颈鳞癌标本术前经活检确诊,均未接受放化疗。所有标本常规行HE染色,经病理证实。同时选取30例因子宫良性病变行全子宫切除术患者的正常宫颈,术后病理确诊均无宫颈病变。

1.2 主要试剂

GMFG抗体购自美国Thermo Fisher Scientific公司,上皮细胞黏附分子标记物E-Cadherin、间质分子标记物Vimentin单克隆抗体均购自美国proteintech公司,SP检测试剂盒购自北京中杉金桥生物技术公司。

1.3 HE染色

在本研究中,我们首先采用HE染色的方法显示组织切片中癌巢和正常宫颈组织基底膜的位置。所有蜡块标本按常规方法固定、包埋,每个蜡块连续切片,厚度约4 μm。片子经二甲苯脱蜡、梯度乙醇水化后,自来水冲洗3次,苏木素染色5 min;流水洗去苏木素;1%盐酸乙醇分化1 s后用自来水冲洗;PBS溶液反蓝10 s;0.5%伊红染色1 min;梯度乙醇脱水,二甲苯透明,中性树胶封片,通风橱晾干后显微镜下阅片、图像采集、统计、保存。

1.4 免疫组织化学法检测

所有蜡块标本按常规方法固定、包埋,每个蜡块连续切片,厚度约4 μm。片子经二甲苯脱蜡、梯度乙醇水化后,采用高压法进行抗原修复,3%过氧化氢去除内源性过氧化物酶,山羊血清37 ℃封闭,GMFG抗体(兔抗人,1 ∶100)、E-Cadherin抗体(兔抗人,1 ∶100),Vimentin抗体(兔抗人,1 ∶200)4 ℃孵育过夜;PBS洗脱一抗,山羊抗兔二抗37 ℃孵育1 h,PBS洗脱,辣根过氧化物酶孵育30 min,DAB显微镜下显色,苏木素复染细胞核,梯度乙醇脱水,二甲苯透明,中性树胶封片,通风橱晾干后显微镜下阅片、图像采集、统计、保存。以PBS代替一抗作为阴性对照。

1.5 结果判定

由2位观察者采用盲法观察免疫组化结果,每张切片随机选取3个有代表性的高倍视野。结果采用半定量计分法判定,方法如下[12]:GMFG及E-Cadherin评分采用染色强度及阳性细胞数百分比综合评价。染色强度评分:无染色为0分,轻度黄染为1分,中度黄染为2分,重度黄染为3分。计数每个组织的3个10×10倍视野下肿瘤细胞的阳性细胞数,阳性细胞数百分比=(阳性表达的肿瘤细胞数/所有肿瘤细胞数)×100%;评分:<10%为0分,10-24%为1分,25-49%为2分,50-74%为3分,75-100%为4分。两类所得评分的乘积为最终结果评分。评分0-4分为低表达,6-12分为高表达。Vimentin评分采用染色强度直接评分:无染色0分,轻度黄染1分,中度黄染2分,重度黄染3分;评分0-1分为低表达,2-3分为高表达。所有样本染色低表达为阴性表达,高表达为阳性表达。

1.6 统计分析

所有资料均由SPSS18.0软件分析处理,计数资料采用Pearson卡方检验,计量资料采用Wilcoxon秩和检验,相关性分析采用Spearman列联系数检验,检验水准取α=0.05,P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 GMFG在宫颈鳞癌及正常宫颈组织中的表达

GMFG蛋白主要表达在宫颈鳞癌的细胞浆内,而在正常宫颈组织中仅表达于基底膜细胞的细胞浆中,其余部位均未有明显表达。免疫组化结果显示,GMFG在宫颈鳞癌组织中的表达(63.33%,19/30)显著高于正常宫颈组织中的表达(20.00%,6/30),差异有统计学意义(P=0.001,见图1,表1)。

图1 GMFG在宫颈癌及正常宫颈组织中的表达Figure 1 Expression of GMFG in cervical cancer and normal cervix tissues

表1 GMFG、E-Cadherin及Vimentin在宫颈癌及正常宫颈组织中的表达 (例)Table 1 Expressions of GMFG, E-Cadherin and Vimentin in cervical cancer and normal cervix tissues (cases)

2.2 EMT标记物E-Cadherin及Vimentin在宫颈鳞癌及正常宫颈组织中的表达

E-Cadherin蛋白主要表达在正常宫颈组织基底膜细胞的细胞膜上,宫颈癌组织中仅表达于部分癌组织细胞中。免疫组化结果显示,E-Cadherin在宫颈鳞癌组织中的表达(30.00%,9/30)显著低于正常宫颈组织中的表达(66.67%,20/30),差异有统计学意义(P=0.004,见图2A-D,表1)。

Vimentin蛋白主要表达在宫颈癌及正常宫颈组织的间质组织中,癌巢组织及宫颈基底膜细胞中鲜见明显表达。免疫组织化学结果显示,Vimentin在宫颈鳞癌组织中的表达(70.00%,21/30)显著高于正常宫颈组织中的表达(40.00%,21/30),差异有统计学意义(P=0.020,见图2E-H,表1)。

图2 EMT相关标记分子在宫颈癌及正常宫颈组织中的表达Figure 2 Expressions of EMT markers in cervical cancer and normal cervix tissues

2.3 宫颈组织中GMFG与EMT表达的相关性分析

经Spearman相关分析结果显示,宫颈组织中,GMFG和E-Cadherin的表达呈负相关(r=-0.271,P=0.036);GMFG和Vimentin的表达呈正相关(r=0.365,P=0.004);而E-Cadherin和Vimentin的表达呈负相关(r=-0.457,P=0.000,见表2)。

表2 宫颈组织中GMFG与E-Cadherin、Vimentin表达的相关性分析Table 2 Correlation analysis of GMFG, E-Cadherin and Vimentin in cervical tissues

3 讨论

宫颈癌具体发病机制尚不明确,其可能由HPV的持续感染导致,宫颈癌的预后与癌细胞的侵袭和转移密切相关。上皮-间质转化机制可能在宫颈癌的发生发展、浸润、转移及肿瘤耐药等过程中起着重要的作用。目前已报道多种与宫颈癌上皮-间质转化相关的分子,包括:可溶性细胞因子、离子通道、细胞骨架调节因子、凝溶胶蛋白、转录因子、跨膜蛋白、微环境、分泌型因子等。而在细胞骨架调节中有着重要的作用的GMFG是否与宫颈癌细胞的EMT仍然未知。

既往研究发现GMFG在卵巢癌及大肠癌中的表达均升高,GMFG表达升高与卵巢癌及大肠癌的临床病理学特征相关,且GMFG的表达越高,患者的无进展生存期(progression-free survival,PFS)及总生存期(overall survival,OS)越差[12,13]。GMFG还可促进大肠癌细胞的迁移及增殖能力。本研究的结果显示:GMFG蛋白主要表达在宫颈鳞癌的细胞浆内,且GMFG在宫颈鳞癌组织中的表达显著高于正常宫颈组织,提示GMFG在宫颈癌中表达上调,其可能参与了宫颈癌的发生和进展。

为了进一步探索GMFG促进宫颈癌变可能的机制,我们检测了组织样本中上皮-间充质转换相关分子标记,结果显示:上皮黏附蛋白标记物E-Cadherin表达下降,间质标记物分子Vimentin表达上调,提示宫颈癌中上皮-间质转化机制处于活化状态。进一步的相关性分析发现:GMFG与E-Cadherin的表达呈负相关,GMFG与Vimentin的表达呈正相关,而E-Cadherin和Vimentin的表达呈负相关,提示在宫颈癌中,异常高表达的GMFG可能加速了细胞由上皮向间质转换的进程,降低细胞的黏附作用,促使癌变的细胞发生迁移,进而向远处转移。

EMT的主要特征是细胞黏附分子表达减少、细胞角蛋白细胞骨架转化为波形蛋白为主的细胞骨架、且形态上具有间充质细胞的特征等[14]。细胞骨架的转化在EMT的过程中起重要作用。而GMFG也证实与细胞骨架相关。在卵巢癌中,GMFG的表达可能通过与Arp2/3复合体相互作用影响肌动蛋白细胞骨架的改变[12]。除了肿瘤细胞,GMFG还可以增强内皮细胞肌动蛋白相关的细胞功能,如细胞迁移及微管形成[15]。而在单核细胞中,GMFG还可以通过抑制α5β1-integrin蛋白酶体的降解调控单核细胞的迁移及黏附[16]。在人T细胞内,GMFG是T细胞伪足的组成成分之一,抑制GMFG的表达,T细胞的迁移能力减弱,而黏附的特性增强,提示GMFG可调控T细胞的迁移及黏附[16]。而本研究发现GMFG的表达与EMT相关,提示GMFG可能通过调控宫颈癌的细胞骨架,参与了宫颈癌的EMT行为。

综上,本研究发现GMFG在宫颈癌中的表达上调,且与上皮-间质转化相关蛋白E-Cadherin的表达呈负相关,与Vimentin的表达呈正相关,提示宫颈癌中异常高表达的GMFG可能通过调节细胞骨架加速了细胞由上皮向间质转化的进程,降低细胞的黏附作用,促进了癌细胞迁移,进而发生转移的行为。