miR-214-3p对肺癌细胞增殖的影响

李玉龙,杨 阳,常素娥

(1陕西省人民医院消化内科,西安 710068;2西安交通大学公共卫生学院;3西安交通大学第二附属医院骨科;*通讯作者,E-mail:liyulong0639@126.com)

肺癌是严重危害人类健康的最常见的恶性肿瘤之一,在我国肺癌发病率及死亡率一直位居前列[1]。肺癌可分为非小细胞肺癌(NSCLC)和小细胞肺癌(SCLC)两大类,大多的肺癌患者在确诊时已处于晚期,而传统的手术和放化疗对晚期肺癌治疗效果有限,患者生存率极,因此探索肺癌的发病机制及寻求有效的治疗手段成为当今的研究热点。近年来研究发现miRNAs在肿瘤发生发展过程中扮演重要角色[2],成为生物治疗领域的一个研究热点。miRNA是一类长约20-25个核苷酸的内源性非编码单链RNA。miRNA通过和靶基因mRNA碱基配对,促使靶mRNA降解或阻遏靶mRNA的翻译,目前已有的研究表明miRNA在增殖、凋亡、侵袭、转移和血管生成等生物过程发挥作用[3]。

miR-214位于1号染色体上,在多种癌症中存在异常表达,且与癌基因及抑癌基因存在相互作用关系[4]。miR-214在不同的肿瘤中扮演着不同的角色,如在食管鳞状细胞癌中,miR-214通过调控PI3K/AKT/mTOR信号通路促进食管鳞状细胞癌细胞转移并抑制其凋亡[5]。在乳腺癌中,miR-214通过靶向p53促进乳腺癌细胞的侵袭[6]。而在肝癌中,miR-214通过抑制β-catenin抑制肝细胞癌细胞生长[7],在食管鳞状细胞癌中,miR-214通过靶向CDC25B抑制食管鳞状细胞癌细胞的增殖和侵袭[8]。在本研究中,我们通过合成miR-214-3p mimics及其对照,合成miR-214-3p抑制剂序列及其对照序列,分别将其转染肺癌A549和H1299细胞中,观察其对肺癌细胞增殖的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

Trizol裂解液,Lipofectamine2000购自Invitrogen公司,逆转录试剂盒、定量PCR试剂盒购自TaKaRa公司。miR-214-3p mimics及对照序列具体由上海吉玛制药技术有限公司合成。miR-214-3p mimics sense:5′-ACAGCAGGCACAGACAGGCAGU-3′, miR-214-3p mimics antisense:5′-UGCCUGUCUGUGCCUGCUGUUU-3′；对照序列sense:5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′,antisense:5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′。miR-214-3p抑制剂序列及抑制剂对照序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。miR-214-3p抑制剂序列:5′-ACTGCCTGTCTGTGCCTGCTGT-3′,抑制剂对照序列:5′-CAGTACTTTTGTGTAGTACAA-3′。A549和H1299细胞购自中国科学院细胞库。

1.2 细胞培养

A549和H1299细胞用含有10%胎牛血清的RPMI1640培养基,放置于5%CO2,37 ℃恒温培养箱中培养。

1.3 转染

将A549和H1299细胞铺入6孔培养板,24 h后待细胞生长密度达到80%左右即可转染,应用Lipofectamine2000分别转染miR-214-3p mimics及其对照序列,miR-214-3p抑制剂序列及抑制剂对照序列至A549和H1299细胞。

1.4 RT-PCR检测miR-214-3p的表达水平

肺癌A549和H1299细胞分别转染miR-214-3p mimics组、mimics对照组,miR-214-3p抑制剂组、抑制剂对照组,转染24 h后,收集A549和H1299细胞,按照Trizol参考说明书提取细胞RNA,应用TaKaRa逆转录试剂盒进行逆转录,U6作为内参,进行实时定量PCR实验,具体程序如下:95 ℃预变性30 s,40个循环:95 ℃变性,5 s,60 ℃退火30 s。以2-ΔΔCt计算miR-214-3p的相对表达量。

1.5 CCK-8实验检测miR-214-3p对肺癌细胞增殖的影响

将A549和H1299细胞铺入96孔培养板，24 h后待细胞生长密度达到80%左右可转染。转染分组:miR-214-3p mimics组、mimics对照组,分别将miR-214-3p mimics与mimics对照(一段与miR-214-3p mimics相应的对照序列)转染至A549和H1299细胞;miR-214-3p抑制剂组、抑制剂对照组,分别转染miR-214-3p抑制剂序列及抑制剂对照序列(一段无义序列)至A549和H1299细胞。转染后24，48，72 h分别加入CCK-8,于37 ℃培养箱放置2 h,取出后用酶标仪在450 nm波长处测定OD值,OD值与活细胞的数量成正比,检测各组细胞生长活力。

1.6 统计学处理

2 结果

2.1 miR-214-3p的转染效率

转染了miR-214-3p mimics的肺癌A549和H1299细胞中miR-214-3p的表达量显著高于对照组(P<0.05,见图1)。说明miR-214-3p mimics能够显著提高miR-214-3p的表达水平。

与对照组比较，*P<0.05

2.2 miR-214-3p抑制剂的转染效率

转染了miR-214-3p抑制剂的肺癌A549中miR-214-3p的表达显著低于转染抑制剂对照组(P<0.05,见图2)。转染了miR-214-3p抑制剂的肺癌H1299中miR-214-3p的表达低于转染抑制剂对照组,但差异无统计学意义。

2.3 miR-214-3p过表达抑制肺癌A549和H1299细胞增殖

转染了miR-214-3p mimics的A549和H1299细胞活性明显受到抑制(P<0.01,见图3)。

2.4 miR-214-3p抑制剂对肺癌A549和H1299细胞增殖能力的影响

转染了miR-214-3p抑制剂后的的A549细胞的细胞活力与对照组比较没有显著差异性。转染了miR-214-3p抑制剂后的的H1299细胞的细胞活力显著高于与对照组(P<0.01,见图4)。

与抑制剂对照组比较，*P<0.05

A. miR-214-3p过表达对肺癌A549细胞活性的影响 B. miR-214-3p过表达对肺癌H1299细胞活性的影响与对照组比较，**P<0.01

A. miR-214-3p抑制剂对肺癌A549细胞活性的影响B. miR-214-3p抑制剂对肺癌H1299细胞活性的影响与抑制剂对照组比较，**P<0.01

3 讨论

miRNA与肿瘤的发生发展密切相关。miRNA通过调控其靶基因,在肿瘤的发生发展中发挥重要作用。随着研究的不断深入,miRNA为肿瘤的诊断和治疗提供了新的思路。既往研究表明多种miRNA参与肺癌的发生和发展,通过如miR-93-5p在非小细胞肺癌中上调,通过抑制PTEN和RB1发挥致癌作用[9],microRNA-454通过靶向STAT3抑制非小细胞肺癌细胞的生长和转移[10]。miR-9-5p通过抑制TGFBR2促进非小细胞肺癌的细胞生长和转移[11]。

本研究分别通过过表达miR-214-3p及抑制miR-214-3p,以期检测miR-214-3p对肺癌细胞增殖的影响。通过real-time PCR检测miR-214-3p mimics转染A549和H1299细胞后是否能够高表达miR-214-3p,miR-214-3p抑制剂转染A549和H1299细胞后是否能够抑制miR-214-3p的表达。研究结果提示miR-214-3p能抑制肺癌细胞的增殖。目前研究发现超过50%的miRNAs位于肿瘤相关的基因组的区域和脆性位点,杂合型丢失区、扩增区或断裂点区[12],在转录后水平调控基因的表达,在肿瘤中发挥着类似癌基因或抑癌基因的作用。我们的实验结果提示miR-214-3p可能在肺癌发生发展过程中发挥抑癌基因的作用,而miR-214-3p抑制肺癌细胞增殖的分子机制值得进一步更深入的研究。