马铃薯晚疫病菌单孢子囊分离技术的改进

谢业焜+吴娥娇+李冬亮+靳宇佳+詹家绥

摘要：针对现行马铃薯晚疫病菌研究中单孢子囊分离方法操作难度大、耗时久、成功率低的问题，在已有的悬浮液分离方法的基础上，利用单个孢子囊含有多个游动孢子，且每个游动孢子遗传物质相同的特点，分离获得单个孢子囊后，采用低温刺激其释放游动孢子，形成了一套分离单个孢子囊的新方法。结果表明，改进后的方法成功率提高了近5倍，操作时间减少了50%，同时操作难度也大大降低，是病原群体研究试验中快速、大批量分离单孢子囊的一种行之有效的方法。该方法成功地应用于马铃薯晚疫病菌（Phytophthora infestans）群体遗传和竞争试验研究。

关键词：马铃薯晚疫病菌；单孢子囊分离；孢子囊；游动孢子

中图分类号： S435.32

文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2016）04-0172-02

马铃薯晚疫病是由致病疫霉（Phytophthora infestans）引起的具有很强的破坏力的、给马铃薯生产造成极大危害的病害[1]，每年因马铃薯晚疫病造成的直接损失高达数10亿美元[2]，因此，明确马铃薯晚疫病的发生、发展和进化规律，对马铃薯晚疫病的管控十分重要。当今研究多集中于病原菌毒力的增减，很少涉及到病原菌的生存策略[3]。在自然环境中，由于寄主资源有限，同一寄主可能会被多个病原菌侵染，病原菌之间会为了有限的资源展开竞争[4-5]。病原菌对寄主多重侵染时会采取什么样的繁殖策略，有什么因素会对其造成影响，目前对此众说纷纭[6-8]。本研究旨在通过探究不同基因型的病原菌侵染同一寄主时，竞争力有何变化，探讨不同病原菌在有限的生存空间中采用何种生存策略。

本研究的技术路线为：（1）选取2个SSR等位基因位点有差异的自育交配型菌株；（2）两两单独、两两混合按1 ∶1的比例接种到马铃薯叶片（感病品种Favorite）上，每处理重复5次；（3）接菌后第3天开始拍照，至第7天结束；（4）从2个不同菌株混合的处理中分离获得50个孢子囊，分别培养，提取DNA，进行SSR分析；（5）使用ASSESS[9]计算病斑大小与发病面积，检验不同等位基因的菌株致病力强弱。

为了得到混合侵染后不同菌株竞争力强弱的结果，必须从混合接种的叶片上分离大量的单孢子囊。而传统的单孢子囊分离方法——水琼脂平板划线法[10]存在以下不足：（1）水琼脂不含营养物质，孢子囊萌发后无法从水琼脂上获取营养，往往难以长到黑麦培养基上；（2）镜检费时费力，即使操作熟练也需要花3～10 min才能完成1个单孢子囊的分离；（3）水琼脂厚度难以控制，太厚不利于镜检，太薄又易碎，难以转移到黑麦培养基上。由于离体的马铃薯叶片在被马铃薯晚疫病菌侵染后极易腐烂，腐烂后的叶片杂菌极多，无法进行单孢子囊分离，而传统的水琼脂平板划线法效率低下，无法满足试验需要。为此，本试验在袁军海等的研究方法[11]基础上进行改进，探寻一种能够快速、高效，适合大批量获取单个孢子囊的方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株 供试菌株分别于2010年、2011年采自云南省和贵州省安顺市，根据省份和市区首写字母依次编号命名为YN3和AS22。

1.1.2 黑麦培养基 黑麦培养基的制作借鉴Caten等的方法[12]：取50 g黑麦于烧杯中，用自来水冲洗干净，加入适量去离子水，室温下浸泡15～20 h，充分研磨后于65 ℃水浴2 h，用4层纱布过滤去渣，加热煮沸并于滤液中加入12 g琼脂粉，待琼脂粉充分融化后用去离子水定容至1 L，分装，灭菌。

1.1.3 主要器材 三目生物显微镜、血球计数板、恒温培养箱、培养皿（直径9 cm）、玻片等。

1.2 方法

1.2.1 水琼脂平板划线法 先倒1层大约1 mm的水琼脂平板，然后将孢子囊悬浮液滴在平板上，于10×10倍显微镜下观察，将含有单个孢子囊的部分小心切下，用镊子将含有孢子囊的一面朝上置于黑麦培养基上，封口，置于18 ℃恒温培养箱中培养，及时观察其萌发情况。

1.2.2 改进后的分离方法 改进后的分离方法具体操作如下：

（1）用接种针从发病的马铃薯叶片上挑取少许菌丝，在含有200 μL无菌水的2 mL离心管中搅拌数次，待接种针上的菌丝和孢子囊混入无菌水后，用转速为1 500 r/min的涡旋机涡旋30 s，重复2次。随后用血球计数板调整孢子囊悬浮液浓度，将孢子囊悬浮液浓度调整到1个/2 μL。（2）于1片载玻片上放置3个已用75%乙醇灭菌的盖玻片，分别在3个盖玻片上滴1滴孢子囊悬浮液，然后于10×10倍显微镜下镜检，若观测到单个孢子囊，则在液滴上加盖1块0.8 cm×0.8 cm 的黑麦培养基，随后将其转移至灭菌过的空培养皿中，封口。（3）将培养皿放至4 ℃冰箱中低温处理2～3 h，刺激孢子囊释放游动孢子[13]，然后转移到11 ℃的环境存放 16～18 h，促进游动孢子萌发[14]，最后放置18 ℃的恒温培养箱中培养4～10 d。（4）待萌发的孢子囊在黑麦培养基块上产生菌丝，在超净工作台中将其转移至黑麦培养基平板上培养，于18 ℃恒温培养箱中培养，即可得到由单个孢子囊生长而来的菌株。

2 结果与分析

2.1 单独侵染与多重侵染病斑面积比较

接种后5 d，YN3菌株单独侵染时相对病斑面积约为12%，AS22菌株单独侵染时相对病斑面积约为7%，而将二者按相同的比例混合，进行多重侵染时，相对病斑面积约为24%，相对病斑面积显著增加了近2倍。

2.2 多重侵染单孢子囊分离情况

YN3菌株所占比例为57%，大于AS22菌株所占的43%，这结果符合单独侵染时，YN3菌株的侵染力大于AS22菌株。

2.3 单孢子囊分离结果

2种单孢子囊分离结果见表1，对同一菌株采用水琼脂平板划线法分离100个孢子囊，最后仅能存活12个分离物，存活率仅为12%；而采用改进后的方法分离100个孢子囊，最后能存活68个分离物，存活率达到了68%，存活率是改进前的5.7倍。

3 讨论

从试验得到的数据来看，将2个不同基因型的马铃薯晚疫病菌混合接种到同一叶片上，在接种量（孢子囊数量）保持一致的条件下，混合侵染后的侵染能力明显大于单独侵染。单独侵染时，YN3的相对病斑面积是AS22的 1.71 倍；混合侵染的叶片上YN3的孢子囊数量是AS22的 1.33 倍。表明单独侵染和混合侵染时，2个菌株毒力的提高大致呈相同比例，也就是说，混合侵染使得2个菌株互相竞争，为了争取更多的生存空间和资源，二者都提高了自身的毒力，使得自身能在竞争中保持竞争力，避免资源被对方完全占据而失去生存空间。

对于混合侵染时病原物的侵染力有何变化，已有众多学者开展了研究[6-8]，前人研究结果表明，由于寄主资源有限，混合侵染会使得病原物之间的竞争加剧，从而使得病原物的侵染力提升[4-5]。然而也有一部分试验观察到，混合侵染不仅没有使病原物的侵染力上升，侵染力相比单独侵染时反而下降了[15]。本研究结果表明，混合侵染后病原物的侵染力出现显著的提升，且二者的竞争力关系没有发生显著的改变。有些试验的结论[15]却与之相反，甚至在相同病原物、相同寄主的试验中也出现了这种情况[3]。今后研究要增加病原物的数量，主要是增加侵染力不同的菌株之间的竞争情况，还有多重侵染时会发生什么情况。将来计划除了本试验中使用的2株马铃薯晚疫病菌株，再增加2株侵染力相当，但是与本试验所使用菌株有明显差异的马铃薯晚疫病菌菌株，按两两组合、3个组合、4个组合进行混合侵染，以便得到更为丰富的试验结果。

当前所使用的单孢子囊分离方法——水琼脂平板划线法明显无法满足如此大量的分离工作。目前，针对马铃薯晚疫病菌的单孢分离对象主要有2种，一是分离游动孢子；二是分离孢子囊。因为游动孢子体积极小，只有配制成悬浮液方能分离。但是配制成悬浮液后，因为游动孢子体积太小，且不断在悬浮液中游动，镜检后也很难确定其位置，所以分离难度大。孢子囊相对游动孢子大得多，而且在悬浮液液滴中不易移动，容易镜检确定位置，便于分离。

污染率高、萌发率低是影响单孢子囊分离存活率的两大主要问题。杨志辉等采用单游动孢子的方法分离马铃薯晚疫病菌，平均分离率可高达51.6%[16]，如果每个游动孢子都有这样的分离率，一个孢子囊有6个以上的游动孢子[17]，完全释放后至少能有3个游动孢子存活。根据上述思路，我们针对单个孢子囊的分离进行改进，用低温刺激的方法促进孢子囊释放游动孢子，进而利用游动孢子的数量来提升存活率。

改进后方法相比较于水琼脂平板划线法，主要改进之处是操作难度降低，工作效率和存活率提高。水琼脂平板划线法首先要镜检，要找到一处只有单个孢子囊的地方，然后还要在显微镜下划线切割，该过程如果操作不当很容易把多余的孢子囊也切割下来。划线切割完成后还要用镊子转移水琼脂块，为了方便镜检，水琼脂平板一般都倒得很薄，所以镊子很容易把水琼脂捏碎，即转移操作难度较大，改进后的方法克服了这一难题。同时，改进后的方法镜检快，只需要检查液滴上是否有单个孢子囊。镜检后操作也很简单，只需要在液滴上加盖1块0.8 cm×0.8 cm的黑麦培养基，再转移到空的培养皿中即可。从实际操作时间来看，改进后的方法大大节省了操作时间，提高了工作效率，为马铃薯晚疫病菌甚至致病疫霉的群体研究带来了极大便利。

参考文献：

[1]Akino S，Takemoto D，Hosaka K. Phytophthora infestans：a review of past and current studies on potato late blight[J]. Journal of General Plant Pathology，2014，80（1）：24-37.

[2]Nowicki M，Foolad M R，Nowakowska M，et al. Potato and tomato late blight caused by Phytophthora infestans：an overview of pathology and resistance breeding[J]. Plant Disease，2012，96（1）：4-17.

[3]Clement J A J，Magalon H，Glais I，et al. To be or not to be solitary：Phytophthora infestans dilemma for optimizing its reproductive fitness in multiple infections[J]. PLoS One，2012，7（6）：e37838.

[4]van Baalen M，Sabelis W. M. The dynamics of multiple infection and the evolution of virulence[J]. American Naturalist，1995，146（6）：881-910.

[5]Brown S P，Hochberg M E，Grenfell B T. Does multiple infection select for raised virulence？[J]. Trends in Microbiology，2002，10（9）：401-405.

[6]Frank S A. Models of parasite virulence[J]. Quarterly Review of Biology，1996，71（1）：37-78.

[7]Davies C M，Fairbrother E，Webster J P. Mixed strain schistosome infections of snails and the evolution of parasite virulence[J]. Parasitology，2002，124（1）：31-38.

[8]Staves P A，Knell R J.. Virulence and competitiveness：testing the relationship during inter-and intraspecific mixed infections[J]. Evolution，2010，64（9）：2643-2652.

[9]冷伟锋，杨 雪，刘 琦，等. 基于ASSESS图像处理软件的植物病害评估[J]. 中国植保导刊，2014，34（2）：10-12.

[10]张书建，何月秋. 介绍一种简单的真菌单孢子分离法[J]. 云南农业大学学报，2003，18（3）：315-316.

[11]袁军海，姚裕琪. 马铃薯晚疫病菌单孢分离技术的改进[J]. 植物保护，2002，28（2）：58-58.

[12]Caten E C，Jinks J L. Spontaneous variability of single isolates of Phytophthora infestans. Ⅰ. Cultural variation[J]. Canadian Journal of Botany，1968，46（4）：329-348.

[13]Latijnhouwers M，Munnik T，Govers F. Phospholipase D in Phytophthora infestans and its role in zoospore encystment[J]. Molecular Plant-Microbe Interactions，2002，15（9）：939-946.

[14]Grenville-Briggs L J，Anderson V L，Fugelstad J，et al. Cellulose synthesis in Phytophthora infestans is required for normal appressorium formation and successful infection of potato[J]. Plant Cell，2008，20（3）：720-738.

[15]Ben-Ami F，Mouton L，Ebert D. The effects of multiple infections on the expression and evolution of virulence in a Daphnia-endoparasite system[J]. Evolution，2008，62（7）：1700-1711.

[16]杨志辉，朱杰华，郭 强，等. 马铃薯晚疫病菌单孢分离物生物学特性的初步研究[J]. 菌物系统，2003，22（1）：148-152.

[17]Bohl W H，Hamm P B，Nolte P，et al. Managing late blight on irrigated potatoes in the Pacific Northwest[M]. University of Idaho Cooperative Extension System，2003. 胡彦江，张茹琴. 光照对花生网斑病菌生长、产孢及致病力的影响[J]. 江苏农业科学，2016，44（4）：174-176 .