马尔尼菲青霉菌病的临床特点与实验室检测

高世华，池细俤，李国玉，吴文辉

(福建医科大学附属南平第一医院 检验科，福建 南平353000)

马尔尼菲青霉菌(penicilliummarneffei,PM)系侵袭性深部双相真菌，多见于AIDS患者，或长期应用免疫抑制剂的患者，但近年来临床上非AIDS患者患马尔尼菲青霉菌病(Penicilliosismarneffei,PSM)也逐年增加。现将某院2015年至2017年间收治的PSM病例资料及PM实验室检测情况进行总结分析。

1 材料与方法

1.1病例资料2015.01-2017.11某院共收治PM感染13例；其中：男12例、女1例；年龄34-79岁； PM菌株来源：分离自患者的痰标本10株、鼻咽部拭子1株、血液标本6株、创口分泌物1株(其中1患者在血液、创口分泌物同时分离出PM，1患者在血液、鼻咽拭子同时分离出、3患者在血液、痰标本同时分离出)。PM检出的月份：一月1例、三月1例、四月2例、六月2例、八月3例、九月1例、十一月3例。

1.2仪器与试剂

1.2.1主要试剂 济南贝瑞特科技有限公司的血平板、沙保弱培养基；珠海贝索生物技术有限公司的棉蓝染色液；法国生物-梅里埃的血培养瓶；ThermoFisher真菌药敏板。

1.2.2主要仪器 法国生物-梅里埃的Bact/Alert120血培养仪；天津泰斯特仪器有限公司的隔水培养箱、MJX-70BX霉菌培养箱。

1.2.3质控菌株 ATCC6258、ATCC22019。

1.3方法

1.3.1菌种鉴定 血培养应用Bact/Alert120血培养仪进行，阳性指示后移种沙保弱培养基；痰标本直接接种沙保弱培养基，分别放置37℃及25℃培养，逐天连续观察，菌种鉴定参照《医学真菌学-实验室检验指南》[1]。

1.3.2药敏试验取培养48 h的37℃培养的酵母相菌落，配成0.5McFarland浓度的菌液，将100 μl菌液加入11 mlYeastOne肉汤，使终浓度为(0.5-5)×104cfu/ml，药敏试验操作按照《ThermoFisher真菌药敏板说明书》，同时取10 μlYeastOne肉汤菌液接种沙保弱培养基进行菌落计数，37℃培养48-60 h观察结果，记录无红色或紫色出现的微孔中药物浓度最低者为MIC值。如ATCC6258、ATCC22019质控结果符合要求，并且菌落计数结果为(50-500)个/平皿，则接受本次药敏结果，如质控结果不符合要求或每平皿菌落小于50或大于500个则重新试验。

1.3.3生物安全 为防止实验人员吸入含PM的气溶胶而感染，所有菌种鉴定及药敏试验均须在B-2生物安全柜内操作。

1.3.4数据分析药敏试验的数据采用WHONET 5.6软件分析。

2 结果

2.1病例资料分析

13例PM感染患者：AIDS患者5例，急性毒蕈中毒1例，慢性支气管炎急性加重期2例，扩张性心肌病1例，支气管扩张并咯血1例，慢阻肺、2型糖尿病1例，肾移植术后1例、肺结核1例。血液检查结果： WBC(2.24-28.54×109/L)、HB(55-138 g/L)、PLT(29-375×109/L)，ALB(20-36.63 g/L)，CRP(均值49.83 mg/L)，SAA(均值119.19 mg/L)；7例患者AST>1×ULN，6例ALT>1×ULN；AST>1×ULN且AST/ALT>1者共6例。患者转归情况：PM感染确诊后，临床采用5-氟胞嘧啶加伊曲康唑联合治疗，除3例患者住院期间死亡外其他均症状好转，死亡病例中：1例毒蕈中毒后多脏器衰竭死亡，1例非正常死亡， 1例考虑与PM感染致病情加重有关。

2.2病原学检测

其中1例患者骨髓涂片见“腊肠”状的PM菌体；PM在沙保弱培养基经25℃培养24 h后出现直径约0.5-3 mm的霉菌相菌落，并菌落周围开始出现鲜红色；用透明胶取霉菌相菌落表面贴载玻片上，加棉蓝染色液显微镜下观察可见分隔菌丝和帚状分生孢子。37℃培养36 h后可见直径约0.5-2 mm酵母相菌落，并从菌落中央开始出现棕红色。

2.3药敏试验

9种抗真菌药物对PM的药敏试验结果见表1，其中5-氟胞嘧啶、伏立康唑、伊曲康唑、泊沙康唑、两性霉素B的MIC50和MIC90较低。

表1 PM的抗真菌药物的MIC50和MIC90结果

3 讨论

人主要是通过呼吸道吸入PM孢子而感染，并在机体免疫力低下时或获得性免疫缺陷时发病。临床上PM感染多见于AIDS患者，但严重疾病的终末期、免疫功能低下及多脏器衰竭的患者也易感染PM[2,3]，本研究病例中非AIDS患者达8/13。提示加强AIDS、严重疾病的终末期、免疫功能低下及多脏器衰竭等患者的管理对降低PSM发病率有重要意义。

PM感染人后主要寄生于巨噬细胞内，人体需通过细胞免疫进行清除，尤其CD4+细胞对于清除PM具有重要作用。CD4+T淋巴细胞数量减少是AIDS患者易继发感染PM的主要因素[4]，且PM可通过刺激AIDS患者体内的HIV-1病毒播散特异性攻击CD4+T淋巴细胞，使患者免疫力持续降低，从而易发生播散性PM感染[2]。病例资料显示AIDS患者感染PM可导致更严重的后果，5例AIDS患者均出现了真菌血症，临床症状加重明显。

本研究中PM感染病例发病时间分布上无季节性特征，福建省的雨季主要在春季的3-4月,夏季的6月，故本组患者发病时间也无明显的旱雨季特征,与陈杏春等研究不一致[5]考虑与福建省地处中国东南沿海全年气候均较潮湿闷热适合PM生长有关[6,7]。随着临床PSM病例的逐年增加，存在PM污染医院环境造成医院内感染的可能，本研究所有患者均是入院后在住院期间感染发病，部分患者可疑符合院内感染诊断标准，应引起院感管理部门的关注。

PM患者的血常规检验项目如WBC、HB、PLT及血清ALB未发现特异性变化；AIDS患者WBC较低与其HIV感染有关。但所有患者的CRP、SAA均显著增高，均值达49.83 mg/l、119.19 mg/l，提示这两个项目可以做为PM感染标志物用于PSM病程或抗真菌疗效观察。部分PSM患者肝脏可发生实质弥漫溶解性坏死、或肝细胞发生脂肪变性、肉芽肿样变、化脓性及无反应性坏死性炎症等病理改变[8]，本组患者中AST>1×ULN且AST/ALT>1者共6例(6/7)；与胡家光等报道相符[9]，即AST>1×ULN且AST/ALT>1可以做为PSM患者肝脏病理变化的辅助指标。

部分PSM患者可无典型临床症状或者症状轻而易被其基础病掩盖，且PSM患者肺部症状与肺结核相似，临床上易发生漏诊、误诊。因此对可疑患者应及时通过采集痰、血液等标本进行真菌培养。目前对PSM的实验室诊断主要依赖传统的真菌培养和组织病理学检查，但偶尔也可在PSM患者的血液涂片或骨髓涂片检测出典型的PM菌体[10]，因此加强血液检验人员对PM镜下形态的识别能力的培训具有一定的临床意义。痰标本接种沙保弱培养基置25℃培养，初培养平均72 h才出现肉眼可见菌落，为了提高阳性率微生实验室对疑似PSM患者的真菌培养需连续观察1周以上。

国内外学者针对PM等双相真菌的药敏试验大多选用酵母相进行试验[11]，但目前PM在内的双相真菌的药敏试验的菌液浓度、孵育温度与时间、判读折点等无权威的标准。本研究也发现药敏试验中PM的菌液浓度不易标准化是导致结果重复性差的重要原因之一，实验中发现不但PM菌落的生长情况及菌丝发育情况差异性很大，而且不同菌落制备的相同McFarland浊度的PM菌液的菌落计数结果可显著差异，因此PM药敏试验中菌液除了要进行McFarland比浊仪测定浓度外，还要同时进行菌落计数，只有菌落计数符合要求才接受本次药敏结果，如不符合则需重新试验，实验室应高度关注。

由于目前CLSI无针对PM的药敏折点，所以药敏结果仅向临床报告PM的MIC值，和本单位PM的MIC50和MIC90统计结果，做为临床医师选药参考。临床上PSM的抗真菌冶疗方案主要是：5-氟胞嘧啶和伊曲康唑联合治疗[12]，本研究药敏结果显示PM对5-氟胞嘧啶、伏立康唑、伊曲康唑、泊沙康唑、两性霉素B的MIC50和MIC90均较低，提示上述药物对PM的敏感性较好。