半乳糖凝集素3对COPD炎症亚型调节机制的研究

陈 默，苏振中，张 群，辛 桐，高 鹏

(吉林大学第二医院 呼吸与危重症医学科,吉林 长春130000)

半乳糖凝集素-3(Gal-3)是凝集素家族的重要成员，主要分布于肿瘤细胞、上皮细胞、巨噬细胞及炎性细胞，可参与调节炎症反应，调节细胞生长，抗凋亡和介导细胞粘附等多种生物学功能[1]。在不同条件下，其生物学功能可表现为促炎和抗炎两种作用。在细胞内，其可充当炎症信号分子，参与固有免疫介导的炎症反应。分泌到胞外的Gal-3可与LPS(脂多糖)直接结合，减少LPS刺激后促炎性细胞因子的产生，从而发挥其抗炎效应[2]。Gal-3在肿瘤、心血管疾病、风湿系统疾病、肾脏疾病中呈高表达，近年来研究发现，Gal-3参与COPD等呼吸系统疾病的发生机制，本研究通过对COPD患者和健康受试者痰上清液中Gal-3水平的测定，旨在明确痰中Gal-3在COPD不同炎症亚型中的表达及作用。

1 材料与方法

1.1一般资料随机纳入在我院呼吸内科就诊的COPD稳定期患者80例，同期招募26例健康受试者为对照组。所有COPD患者均符合2017年GOLD指南制定的COPD诊断标准[3]，具体纳入标准：(1)肺功能检查：吸入支气管舒张剂后，第一秒用力呼气容积(FEV1)/用力肺活量(FVC)<0.7,且FEV1占预计值的百分比<80%。(2)COPD患者处于稳定期，即咳嗽、咳痰、呼吸困难等症状近期无加重。排除标准：患有缺血性心脏病、充血性心力衰竭、肾衰竭、肿瘤、肺间质纤维化、哮喘和活动性结核的患者。收集并记录患者一般资料、临床信息、病史等，同时进行体格检查、肺功能检查以及诱导痰检测。根据诱导痰炎症细胞计数将COPD患者分为2种亚型，即：嗜酸性粒细胞型COPD(痰液嗜酸性粒细胞超过2.5%)和非嗜酸性粒细胞型COPD(痰液嗜酸性粒细胞少于2.5%)。本研究已由吉林大学第二医院伦理委员会通过，所有参加者均已签署知情同意书。

1.2方法

1.2.1肺功能检查 所有参加者都进行肺功能检查，具体按照ATS2014年发表的肺功能指南进行[4]。

1.2.2诱导痰细胞计数及分类 我们对所有参与者均使用4.5%的浓氯化钠进行痰诱导15 min，从痰液中分离痰栓后，使用4倍体积的二硫苏糖醇(DTT)分散细胞，37℃旋转混合30 min，并将细胞重悬于磷酸缓冲盐溶液(PBS)中，过滤悬浮液并进行总细胞计数并应用台盼兰染色进行细胞活力测定。同时将悬浮液离心，留取痰上清液，进行细胞涂片，然后甲醇、苏木精伊红(HE)、铬变酸2R染色后进行细胞计数。根据高倍视野下嗜酸性粒细胞所占比例分为嗜酸性粒细胞型COPD和非嗜酸性粒细胞型COPD，具体诱导痰的采集方法与标本处理均按推荐步骤进行[5]。

1.2.3半乳糖凝集素3浓度测定 痰上清Gal-3水平使用定量的酶联免疫吸附试剂盒测定(R&D Systems，Minneapolis，MN，USA)，详细步骤按试剂盒说明书操作。

1.3统计学方法应用SPSS 20统计软件对数据进行处理，定量资料先行正态性检验,呈正态分布的变量用均数±标准差表示，呈非正态分布的数据采用中位数表示，定性资料采用t检验。多组资料比较采用单因素方差分析。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1基线资料分析本研究共收集COPD试验组80例，男37例，女43例，健康对照组26例，男10例，女16例。比较两组性别、BMI值均无明显差异(P值分别为0.579，0.07)，而COPD组年龄和吸烟指数明显高于对照组(P<0,001,P=0.002)，且83%的COPD患者应用糖皮质激素。诱导痰细胞计数结果显示：与健康对照组相比，COPD组痰中的炎症细胞总数明显升高(P=0.029)，且以中性粒细胞和嗜酸性粒细胞升高为主，差异显著，具有统计学意义。接下来对两组痰中的Gal-3和炎性因子IL-6结果进行分析，结果显示：两组相比，Gal-3的表达无明显差异(P=0.862)，而COPD组中IL-6的表达水平则明显高于健康对照组(P=0.012)(表1)。根据炎症亚型分类标准和诱导痰的检测结果对COPD组进行分类：嗜酸性粒细胞型COPD患者24例，非嗜酸性粒细胞型COPD患者56例。然后对嗜酸性粒细胞型COPD和非嗜酸性粒细胞型COPD患者的年龄、性别、BMI、肺功能检查、糖皮质激素应用、痰中炎症细胞计数进行比较，均无明显差异(P>0.05)(表2)。

表1 两组患者临床特征比较

注：*非正态分布的数据采用中位数(四分位间距)表示。GAL-3数据标准化用ANCOVA校正(年龄、BMI、吸烟)。

表2 不同COPD炎症亚型患者临床特征比较

注：*非正态分布的数据采用中位数(四分位间距)表示。

2.2COPD组中Gal-3和炎性因子分析我们对COPD组中嗜酸性粒细胞亚型和非嗜酸粒细胞亚型中的炎性因子进行分析，结果显示：与非嗜酸性粒细胞性COPD(Gal-3=285.1)相比，嗜酸粒细胞性COPD(Gal-3=467.7)痰中的Gal-3表达较明显升高，其水平相差近2倍，差异显著，具有统计学意义。而其他炎性因子检测结果显示，嗜酸性粒细胞型COPD的IL-6、CRP和SAA表达明显低于非嗜酸性粒细胞型COPD(P<0.05)(图1)。相关性分析显示：COPD患者痰中Gal-3表达与嗜酸性粒细胞计数、巨噬细胞计数呈明显正相关，而与中性粒细胞呈明显负相关，差异具有统计学意义(P<0.05)(图2)。

图1 嗜酸性粒细胞型COPD和非嗜酸性粒细胞型COPD患者各炎性介质水平比较

图2 COPD患者Gal-3水平与各炎症细胞之间的关系

3 讨论

COPD是一种气流受限不完全可逆、呈进行性发展，与气道和肺部对有害颗粒或有害气体的慢性炎症反应增强有关的疾病，并导致患者FEV1逐年下降速度明显高于正常人。最新统计数据显示，中国COPD的总发病率为8.6%，而40岁以上人群中COPD的患病率则高达13.7%[6]。据WHO预计，到2030年COPD将成为全球致死病因第3位，成为我国一个重要的公共卫生问题[7]。在COPD的发生机制中，炎症因素在COPD的发病机制中发挥重要作用，以中性粒细胞、巨噬细胞、T淋巴细胞等慢性炎症细胞浸润为主要特征。这些细胞分泌的炎症介质和酶，可诱导气道炎症和结构的变化。我们课题组的前期工作利用诱导痰炎症细胞计数分类技术，从病理生理学角度将COPD分为如下四个亚型，即：嗜酸性粒细胞型、中性粒细胞型、混合性粒细胞型和粒细胞缺乏型[8]，由于各个亚型的病理生理表现以及对药物治疗反应存在明显差异，因此临床上区分COPD炎症亚型对指导治疗至关重要。

Gal-3是嵌合型半乳糖凝集素的独特成员，广泛分布并定位于细胞外，细胞质和核区域。其与细胞表面的β-半乳糖苷结合而显示细胞外和细胞内功能[9]。Gal-3在细胞外起着活化炎症细胞的作用。Gal-3可通过其凝集素功能激活巨噬细胞发挥吞噬作用，并可促进IL-1β，IL-6、TNF-α等炎症因子的表达，在炎症早期发挥促炎作用。在炎症后期抑制炎症过度反应而促进组织修复。且有研究表明，外源性Gal-3可提高巨噬细胞吞噬凋亡上皮细胞的能力[10]。巨噬细胞活性增加，可能更有效地清除气道中的病原体和凋亡细胞，其中包括中性粒细胞。体内实验也证实了Gal-3抑制了中性粒细胞的渗出，同时增加凋亡中性粒细胞的消除[11,12]。

在我们的研究中发现，非嗜酸性粒细胞型COPD中Gal-3表达明显下降，且Gal-3表达水平与中性粒细胞计数呈负相关，一方面提示中性粒细胞在肺内渗出减少，另一方面巨噬细胞吞噬功能下降，尤其吞噬凋亡中性粒功能下降，导致中性粒炎症介质释放，增加气道炎症水平。同时，在非嗜酸性粒细胞型COPD中，IL6、CRP、SAA水平明显增高，提示在此亚型中气道炎症水平明显高于嗜酸性粒细胞型COPD。

另有研究证实，Gal-3在炎症性肠病患者肠上皮细胞中的表达显著下降[13]，Gil CD的研究也发现在大鼠腹膜炎模型中，炎症早期Gal-3表达明显降低[14]，Gal-3敲除的大鼠肺组织显示弥漫性炎症，这与我们的研究结果一致，提示Gal-3在炎症性疾病中可能表现为抗炎作用，这也为炎症性疾病提供了一种新的潜在的治疗靶点[15]。

本研究结果提示Gal-3参与了COPD患者 的炎症亚型发病机制，调节了气道炎症细胞分布，降低了气道炎症水平，起到了抗炎作用。因此，Gal-3可能成为临床鉴别COPD炎症亚型的新介质，并可能成为COPD个体化治疗的新靶点。