丹参酮ⅡA对N-甲基-D-天冬氨酸诱导的视网膜神经节细胞损伤的保护作用

苏志彩 邵蔚 张芳玲

视网膜组织的损伤性疾病如糖尿病视网膜病变、视网膜变性、视网膜中央动脉阻塞在临床上较为常见。视网膜损伤后,视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells,RGCs)障碍,甚至凋亡,视觉信息的整合和传递就会受到损害,从而导致视力受损[1]。寻找适当的药物阻断、逆转甚至预防视网膜细胞的凋亡既是治疗疾病的关键,又是目前临床急需解决的问题之一。

由于中药具有靶点多、不良反应小、协同效果好等优点,学者们对于其在视网膜神经保护作用方面的研究一直方兴未艾。丹参酮ⅡA为中草药丹参的主要有效成分之一,具有抗炎、抗菌、抗肿瘤等活性,另外还具有保护神经细胞和心血管等方面的作用。Qian等[2]研究发现丹参酮ⅡA 可以上调损伤的体外培养的神经元内 Bcl-xL,进而抑制神经元凋亡。谷氨酸(Glu)是一种兴奋性氨基酸,视网膜损伤过程中,RGCs的凋亡和Glu的释放有关,因此抑制Glu活性,尤其是对N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)型受体的调节,已经是视神经保护的重要措施。有研究表明丹参酮ⅡA预处理可促进星型胶质细胞活化增生,减轻NMDA诱导的脑损伤[3]。因此本实验采用NMDA诱导小鼠视网膜神经节细胞系RGC-5细胞凋亡,观察丹参酮ⅡA对RGCs的保护作用。

1 材料与方法

1.1 材料 RGC-5细胞(ATCC公司)、丹参酮ⅡA (上海源叶生物有限公司)、引物(上海生工生物技术工程有限公司)。NMDA、四甲基偶氮唑蓝(MTT)、地卓西平 (MK-801, NMDA受体拮抗剂)、hoechst 33258染料均购自Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养:将RGC-5细胞放置于含10%的胎牛血清DMEM培养液中,在5%CO2,37 ℃的培养箱中培养,用0.25%的胰蛋白酶每2～3 d消化传代1次。

1.2.2 MTT比色法测定细胞存活率:在96孔培养板内种植RGC-5细胞(1×105/mL),贴壁后将细胞分为4组:NMDA损伤组、正常对照组、MK-801阳性对照组、丹参酮ⅡA预保护组,每组设6个复孔。丹参酮ⅡA预保护组又分为3个亚组,分别加入0.4μg/mL、4μg/mL、40μg/mL的丹参酮ⅡA;MK-801阳性对照组加入MK-801使其终浓度为10μmol/L;NMDA损伤组和正常对照组加入等体积的DMEM完全培养基。将培养板放置于5%CO2,37 ℃的细胞培养箱内培养12 h,然后取出细胞弃去培养基,磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗3遍。除正常对照组以外,其余各组均加入甘氨酸10μmol/L和NMDA 100μmol/L作用30 min,PBS冲洗3遍后恢复到原来的培养液环境。36 h后每孔加入20μL新鲜配置的MTT(5 mg/mL),在波长490 nm处用酶标仪测定吸光度(OD值),计算细胞存活率。

1.2.3 Hoechst 染色:按上述方法将培养在盖玻片上的细胞分组和处理后(依据上述MTT结果,丹参酮ⅡA预保护组选用4μg/mL 的药物浓度),用多聚甲醛(4%)固定,PBS冲洗3次,然后加入 hoechst 33258工作液染色5 min,漂洗3遍后封片,用荧光显微镜观察结果。荧光显微镜下,活细胞被染成均质的蓝色荧光,呈椭圆形,而凋亡的细胞核呈浓染亮蓝色颗粒块状,核固缩。随机选取6个视野计算凋亡百分率(凋亡百分数=凋亡细胞核数/细胞核总数)。

1.2.4 半定量逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测Bcl-2、Bax的mRNA表达:提取4组细胞总RNA(采用Trizol一步法),逆转录反应得到cDNA,以cDNA为模板(2μL),按照半定量RT-PCR试剂盒提供的步骤进行扩增。Bcl-2上游引物5′-CTTTGAGTTCGGTGGGGTC-3′,下游引物5′-CCCAGCCTCCGTTATCCT-3′;内参磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)上游引物5′-CCATGTTCGTCATGGGTGTGAACCA-3′,下游引物5′-GCCAGTAGAGGCAGGGATGATGTTC-3′;Bax上游引物5′-GCAAACTGGTGCTCAAGGC-3′,下游引物5′-GGGGTCCCGAAGTAGGAGA-3′。扩增的Bcl-2、Bax目的片段长度均为161 bp,内参GADPH长度为520 bp。采用含溴化乙锭的1%的琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物,Kodak凝胶电泳图像系统进行扫描分析。

2 结果

2.1 丹参酮ⅡA对RGC-5细胞活性的影响 与NMDA损伤组相比,MK-801对照组与丹参酮ⅡA预保护组中的4μg/mL和40μg/mL亚组细胞生存率显著提高(P<0.05),0.4μg/mL丹参酮ⅡA预保护亚组的细胞生存率差异无统计学意义(P>0.05)。其中4μg/mL和40μg/mL亚组间的细胞生存率差异无统计学意义(P>0.05),因此,选择4μg/mL的药物浓度为后续的有效药物浓度。见图1。

注:与NMDA损伤组比较,*P<0.05图1 各组RGC-5细胞存活率

2.2 丹参酮ⅡA对RGC-5细胞形态的影响 正常对照组RGC-5细胞呈单层生长,贴壁性好,透光性好,细胞核较大,有较短的突起,随着细胞的生长,突起可以互相连接;NMDA损伤组RGC-5细胞则皱缩、变圆,透亮度消失,甚至仅剩细胞碎片;MK-801阳性对照组及丹参酮ⅡA预保护组RGC-5细胞仍保持正常细胞轮廓,皱缩变形,但程度较轻。见图2。

注:a:正常对照组;b:NMDA损伤组;c:MK-801阳性对照组;d:丹参酮ⅡA预保护组图2 各组RGC-5细胞的形态(倒置相差显微镜×20)

2.3 丹参酮ⅡA对RGC-5细胞凋亡的影响 Hoechst染色检测凋亡细胞,NMDA损伤组的凋亡细胞百分率为(37.4±0.56)%,而正常对照组为(3.25±1.12)%,差异有统计学意义(P<0.05);丹参酮ⅡA预保护组和MK-801阳性对照组细胞凋亡百分率分别为(5.9±1.05)%和(6.7±1.43)%,差异无统计学意义(P>0.05),但均明显低于NMDA损伤组(P<0.05)。见图3。

注:A:正常对照组;B:NMDA损伤组;C:MK-801阳性对照组;D:丹参酮ⅡA预保护组图3 各组Hoechst 染色结果

2.4 丹参酮ⅡA对RGC-5细胞内Bcl-2、Bax 的mRNA水平影响 与正常对照组相比,NMDA损伤组Bcl-2的mRNA表达降低(0.27±0.08),Bax的mRNA表达增加(5.23±0.16),差异有统计学意义(P<0.05);与NMDA损伤组比较,丹参酮ⅡA预保护组Bcl-2的mRNA表达增加(0.84±0.16),Bax的mRNA表达下降(1.57±0.10),差异有统计学意义(P<0.05)。见图4。

3 讨论

RGCs的凋亡是视网膜退行性眼病的共同病理特点,可导致视功能不可逆性损害,直至失明。目前普遍认为Glu受体遍布视网膜各层,糖尿病视网膜病变等疾病使细胞外 Glu大量聚集,造成靶细胞损害,并且主要影响RGCs[4]。众多证据表明,Glu大量聚集后激活RGCs细胞膜上大量的NMDA受体,引起细胞外Ca2+内流及细胞内钙库的Ca2+动员,导致细胞内Ca2+超载,过量的Ca2+激活细胞内依赖Ca2+的信号级联途径,最终导致神经细胞凋亡[5]。

RGC-5属于未分化的幼稚细胞,除不具有电生理学特性外,其他生物学行为和原代培养RGCs基本相似,因此近年来在实验研究中广泛应用。该模型克服了RGCs原代培养难分离、培养条件要求高、不能传代等弊端。Glu作为一种主要的兴奋性神经递质在视网膜上发挥重要作用,NMDA受体是Glu受体的一种亚型,在病理状态下,NMDA受体被激活,从而引起RGCs的凋亡,本实验在体外模拟RGCs损伤后的微环境,即在体外培养的RGC-5中加入NMDA,成功诱导了RGCs凋亡。

注:A:Bcl-2 mRNA;B:Bax mRNA;Tan ⅡA:丹参酮ⅡA图4 各组Bcl-2 mRNA和Bax mRNA的琼脂糖凝胶电泳图

丹参酮ⅡA是近年来国内外研究开发的热点之一。大量研究表明,丹参酮ⅡA有多种生物学活性,对脑神经具有保护作用,如抗氧化、防止神经细胞凋亡、维持脑内离子稳态、保护血脑屏障等,是潜在的神经保护中药单体。有学者发现丹参酮ⅡA 预处理可促进缺血后星型胶质细胞活化增生,减轻缺血性脑损伤[6]。也有学者发现丹参酮预处理可以通过减少神经节细胞的凋亡对视网膜缺血再灌注损伤起保护作用,其作用机制可能是通过调节Bcl-2的表达来实现[7]。本研究结果显示,与NMDA损伤组相比,丹参酮ⅡA预保护组的RGC-5细胞损伤明显减轻,当丹参酮ⅡA达4μg/mL的浓度时,RGC-5存活率可有效提高,但浓度增高至40μg/mL时,神经元保护作用反而并没有增加,此结果与刘美琳等[8]的研究结果基本一致,说明丹参酮ⅡA的保护作用仅在一定范围内呈浓度依赖性。我们又进一步将丹参酮ⅡA预保护组和MK-108阳性对照组进行比较,发现两者差异无统计学意义,从而进一步证实了丹参酮ⅡA的视网膜神经保护作用。韩若东等[9]研究发现,丹参酮ⅡA对大鼠早期脑缺血和脑缺血再灌注损伤具有保护作用,其作用机制可能是上调Bcl-2表达、下调Bax表达。本实验也显示丹参酮ⅡA预保护后能逆转NMDA处理后引起的Bcl-2 mRNA的表达下降,Bax的mRNA表达上调,从而起到神经保护作用。

本实验利用NMDA诱导建立RGCs损伤模型,并证实丹参酮ⅡA通过调节Bax、Bcl-2的表达抑制NMDA诱导的细胞凋亡,为进一步的体内研究和临床应用提供理论依据。