山莨菪碱对电离辐射致耳蜗损伤防护作用的电镜观察

金大玉 印有亮

山莨菪碱作为毒蕈碱型(M型)乙酰胆碱受体竞争性阻断剂除M受体阻断作用外尚有许多其他重要的治疗作用，它可通过多种途径调节微循环和发挥细胞保护作用，目前已经广泛应用于治疗休克、心血管系统疾病、糖尿病、血液系统疾病等，但是山莨菪碱在治疗内耳疾病方面的研究不多，仅有一些关于噪声性聋[1,2]、梅尼埃病和突发性聋等疾病的临床应用报道，在对耳蜗辐射损伤保护作用方面尚未见文献报道。因此，本研究旨在通过电镜观察应用山莨菪碱后豚鼠耳颞部电离辐射后耳蜗毛细胞的形态变化，探讨山莨菪碱对耳蜗放射损伤的保护作用，并初步探讨其机制。

1 材料与方法

1.1实验动物与分组 采用耳廓反应灵敏的健康豚鼠25只，随机分成3组：正常对照组5只，观察双耳共10耳；单放组10只，观察左耳共10耳；防护组10只，观察左耳共10耳。每次放射前30分钟，防护组按20 mg/kg体重股部肌肉注射山莨菪碱，对照组和单放组注射等量生理盐水。

1.2电离辐射方法 单放组及防护组豚鼠不麻醉，用热塑面膜固定，专用X线模拟定位机定位；暴露头部，用医用直线加速器所产生的6 MeV电子线进行分次照射，每次2 Gy,每周5次，共30次，累计剂量60 Gy。对照组不预照射。

1.3扫描电镜标本制备及观察 各组选择8耳，进行2.5%戊二醛活体心脏灌注，灌流固定后，去除前庭膜，尽可能地暴露螺旋器。在解剖显微镜下定位，将要观察的部分面朝上，用导电胶固定在样品台上。然后进行镀膜，随即在日立S—450型扫描电镜下观察耳蜗毛细胞的形态学变化并拍照。

1.4透射电镜标本制备及观察 各组随机选择2耳，进行2.5%戊二醛活体心脏灌注，灌流固定后，在解剖显微镜下取出基底膜，继续进行梯度乙醇脱水、浸透、包埋、聚合、修块、切半薄切片、染色定位、制刀和制备水槽、制备支持膜网、超薄切片、染色过程后，最后用透射电镜进行观察。

2 结果

2.1一般状态观察 各组豚鼠在放射中及放射后均无头部偏斜及行走时倾倒趋势，饮食可，无明显消瘦，无死亡。

2.2透射电镜观察结果 正常对照组耳蜗外毛细胞边界清楚，细胞无肿胀，表皮板完整，线粒体嵴完整，核膜完整(图1)。单放组耳蜗的外毛细胞边界不清，细胞肿胀变形；表皮板疏松、不规则、局部变薄；线粒体空泡变，线粒体嵴断裂；胞浆内可见许多无结构区；核膜不完整，异染色质增多(图2)。防护组耳蜗外毛细胞边界较清，细胞略肿胀；表皮板完整，线粒体嵴较完整，核膜较完整(图3)。

2.3扫描电镜观察结果 对照组耳蜗外毛细胞静纤毛排列呈V字形，纤毛排列整齐，静纤毛僵直度正常(图4)。单放组耳蜗外毛细胞静纤毛排列失去其正常的V字形，纤毛明显融合、倒伏、缺失、排列紊乱，表皮板软化、塌陷(图5)。防护组耳蜗外毛细胞静纤毛僵直度正常，排列基本整齐，偶见倒伏现象(图6)。

图1 对照组透射电镜观察 外毛细胞边界清楚,细胞无肿胀;表皮板完整;线粒体嵴完整;核膜完整(×2 000倍) 图2 单放组透射电镜观察 外毛细胞边界不清,细胞肿胀变形;表皮板疏松、不规则、局部变薄;线粒体空泡变,线粒体嵴断裂;胞浆内可见许多无结构区;核膜不完整,异染色质增多(×2 000倍) 图3 防护组透射电镜观察 外毛细胞边界较清,细胞略肿胀;表皮板完整;线粒体嵴较完整;核膜较完整(×2 000倍)

图4 对照组扫描电镜 外毛细胞静纤毛排列呈V字形,纤毛排列整齐,静纤毛僵直度正常(×2 000倍) 图5 单放组扫描电镜 外毛细胞静纤毛排列失去正常的V字形,纤毛明显融合、倒伏、缺失、排列紊乱,表皮板软化、塌陷(×2 000倍) 图6 防护组扫描电镜 外毛细胞静纤毛僵直度正常,排列基本整齐,偶见倒伏现象(×2 000倍)

3 讨论

山莨菪碱对耳蜗辐射损伤防护的机制可能与其通过多种途径调节内耳微循环及其细胞保护作用有关。电离辐射对耳蜗的损伤，一方面是直接作用于感觉细胞的膜结构，如细胞膜、线粒体膜、溶酶体膜等，发生脂质过氧化从而产生一系列的自由基反应，损伤毛细胞。对山莨菪碱抗氧化机理的研究发现，它对次黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶体系中产生的超氧阴离子自由基有显著剂量依赖性清除作用[3]，因此可通过抗氧化作用减少自由基引发的脂质过氧化反应，从而发挥保护内耳毛细胞的作用。电离辐射对耳蜗损伤的另一机制可能是辐射引起血管纹及其中微小血管的损伤[4]，导致血-迷路屏障的形态结构损害[5]，而造成内耳微循环障碍。山莨菪碱可抑制血栓烷A2的合成，抑制血小板及粒细胞的聚集，增强微血管的自律运动，使微血管血流速度加快和血流量增加；实验证明它可以明显降低红细胞膜脂质过氧化物的量，增加红细胞膜的流动性，使红细胞的变形能力增强，从而改善血流变学的特性[6]；山莨菪碱除可通过神经调节阻断M受体对抗儿茶酚胺引起的血管痉挛外，还可通过促进一氧化氮合酶活性，催化L精氨酸转变为一氧化氮，后者弥散或载体转运至血管平滑肌，激活胞酶，使内鸟苷酸环化cGMP升高而扩张血管[7]。山莨菪碱通过上述多种途径，改善内耳微循环，从而发挥其对内耳辐射损伤的保护作用。本实验扫描电镜和透射电镜观察结果示，单放组耳蜗外毛细胞失去正常结构，而放射前注射山莨菪碱的防护组耳蜗外毛细胞基本正常，证实山莨菪碱对耳蜗外毛细胞具有明显的防护作用。