阿那曲唑阴道环中有关物质检测的方法学研究
2018-11-22邱顺晨刘振齐谷翊群宁美英
邱顺晨 杨 森 刘振齐 谷翊群 宁美英*
1.国家卫生计生委科学技术研究所(北京，100081); 2.中国人民武装警察部队北京市总队
阿那曲唑(ATZ)是一种强效的选择性三唑类芳香化酶抑制剂，为第三代芳香化酶抑制剂的代表药物，它具有选择性高，特异性强，副作用明显降低等特点。能有效抑制细胞色素P-450 所依赖的芳香化酶，从而阻断雌激素的生物合成那曲唑口服片剂常用于治疗经他莫昔芬及其它抗雌激素疗法治疗后仍不能控制的激素敏感型绝经后晚期乳腺癌，以及绝经后妇女的早期乳腺癌，有良好的治疗效果[3-5]。临床研究表明，1 mg的阿那曲唑与复方口服避孕药(0.1 mg/d左炔诺孕酮+0.02 mg/d炔雌醇)联用可缓解子宫内膜异位症造成的盆腔疼痛[6]。因此，阿那曲唑有望成为子宫内膜异位症的治疗药物。目前已上市的阿那曲唑剂型为片剂，考虑到子宫内膜异位是一种慢性疾病，需长期用药治疗等问题，将阿那曲唑制备成缓释给药制剂成为研究热点。阴道环给药系统(IVR)是生殖健康领域常用的一种给药剂型[7]，是由硅橡胶弹性体或热塑性材料制成的环状给药装置，具有使用方便，子宫靶向效应，血药浓度平稳等特点。考虑子宫内膜异位症的病灶部位特点，将阿那曲唑制成阴道环制剂，局部应用于病灶部位，能够达到靶向治疗子宫内膜异位症的目的[8]。本试验采用了注塑成型法制备阿那曲唑阴道环，建立了阿那曲唑阴道环中有关物质的高效液相色谱(HPLC)检测方法，并进行方法学验证，为阿那曲唑阴道环制剂的质量控制提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 药品与试剂
阿那曲唑原料药(批号：S0628A，大连美仑生物技术有限公司)；MED-6382液体硅橡胶(批号80820，美国 Nusil Technology)；MED-6382固化剂(批号80820，美国 Nusil Technology)；乙腈(色谱纯，批号112189，赛默飞世尓科技有限公司)；甲醇(色谱纯，批号152836，Fisher-Scientific公司)；浓盐酸(分析纯，批号20131113，北京化工厂)；氢氧化钠(分析纯，批号20160619，北京化工厂)；纯水(纯净水，批号20170309，杭州娃哈哈集团有限公司)。
1.2 仪器
Sartorius-BT224S 电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)；CSR-4-10 超纯水机(北京爱斯泰克科技开发有限公司)；阴道环模具(北京东洛机电有限责任公司)；ED23 型烘箱(德国宾得公司)；YG120药物光照试验箱(上海一恒科技有限公司)；RT5型磁力搅拌器(IKA公司)；Waters2695高效液相色谱仪(沃特世科技有限公司)；Waters2487检测器(沃特世科技有限公司)；色谱柱(北京迪马科技有限公司)。
1.3 阿那曲唑阴道环的制备
将阴道环模具80℃烘箱预热15 min。称取阿那曲唑原料药0.8 g，MED-6382硅胶8g，混合均匀后加入固化剂，继续搅拌15 s。快速将混合物加入到10 ml注射器中，匀速且快速注入到预热好的模具中。将模具放到80 ℃烘箱中加热30 min，成型后开模取出。
1.4 实验方法
1.4.1色谱条件色谱柱，Diamonsil C18(2) (250mm×4.6 mm，5 μm)；流动相，乙腈-水(42:58，v/v)；阿那曲唑的检测波长，210 nm；柱温，35℃；流速，1.0 ml/min；进样体积，20 μl。
1.4.2供试品溶液的配制取阿那曲唑阴道环，切成0.5 mm薄片，置于装有100 ml甲醇的锥形瓶中，室温下磁力搅拌24 h， 经0.45 μm 滤膜滤过。取续滤液0.5 ml于50 ml量瓶中，用乙腈-水(42:58，v/v)稀释至刻度，摇匀，作为阿那曲唑的供试品溶液，于4 ℃冷藏备用。
1.4.3自身对照溶液的配制精密量取阿那曲唑供试品溶液1.0 ml，置于100 ml量瓶中，用乙腈-水(42:58，v/v)稀释至刻度，摇匀，为阿那曲唑对照溶液，于4℃冷藏备用。
1.5 专属性试验
1.5.1空白干扰试验按照1.3的方法，制备两个空白阴道环。将其均匀切成薄片(厚度0.5 mm)，分别置于装有100 ml甲醇的具塞锥形瓶中，磁力搅拌24 h，经0.45 μm 滤膜滤过，按照1.4.2配制供试品溶液样品2份，进样分析，记录色谱图。
1.5.2酸破坏取阿那曲唑阴道环，切成0.5 mm薄片，置于具塞锥形瓶中，再加1 mol/L盐酸溶液适量，完全浸泡阴道环薄片，于室温放置24 h，加0.1 mol/L NaOH溶液调至中性，加100 ml甲醇。室温下磁力搅拌24 h，经0.45 μm滤膜滤过， 取续滤液1 ml用乙腈-水(42:58，v/v)稀释成100 ml，摇匀，HPLC进样记录峰面积数据。
1.5.3碱破坏取阿那曲唑阴道环，切成0.5 mm 薄片，置于具塞锥形瓶中，加入1 mol/L NaOH溶液适量，完全浸泡阴道环薄片，于室温放置24 h， 加0.1 mol/L 盐酸溶液调至中性，再加100 ml甲醇。然后同1.5.2方法制备供试品溶液，HPLC进样记录峰面积数据。
1.5.4氧化破坏取阿那曲唑阴道环，切成0.5 mm薄片，加3% 过氧化氢溶液适量，完全浸泡阴道环薄片，室温放置8 h，加100 ml甲醇。然后同1.5.2方法制备供试品溶液，HPLC进样记录峰面积数据。
1.5.5高温破坏取阿那曲唑阴道环，切成0.5 mm 薄片，置于具塞锥形瓶中，于60 ℃烘箱中放置24 h后至室温，加100 ml甲醇。然后同1.5.2方法制备供试品溶液，HPLC进样记录峰面积数据。
1.5.6光照破坏取阿那曲唑阴道环，切成0.5 mm 薄片。于(4500±500)Lx光照条件下放置48 h，置于具塞锥形瓶中，加100 ml甲醇。 然后同1.5.2方法制备供试品溶液，HPLC进样记录峰面积数据。
1.6 检测限
取阿那曲唑对照品溶液不断稀释，按照1.4.1色谱条件进行检测， 直到信噪比(S /N)为3/1，得到阿那曲唑的检测限。
1.7 精密度试验
取阿那曲唑对照品溶液，以1.4.1的色谱条件进样分析，一天内重复测定6次，计算测定结果的相对标准偏差(RSD)。
1.8 重复性试验
取同一批号样品，按1.4.2项下供试品制备方法平行制备阿那曲唑供试品溶液，按1.4.3项下自身对照溶液制备方法平行制备阿那曲唑自身对照溶液各6份，以1.4.1的色谱条件进样分析，计算测定结果的相对标准偏差(RSD)。
1.9 溶液稳定性试验
取阿那曲唑供试品溶液，以1.4.1的色谱条件，分别于0，4，8，12，20，24 h时进样， 记录主成分、有关物质及杂质的峰面积，考察样品稳定性。
1.10 有关物质检查
取3批阿那曲唑阴道环，分别按照1.4.2方法制备阿那曲唑供试品溶液，所得阿那曲唑供试品溶液按照1.4.3项制备自身对照溶液，分别精密量取20 μl注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰的峰高约为满量程的10%，再精密量取供试品溶液和对照液各20 μl，分别进样，记录色谱图至主成分峰保留时间的2倍。供试品溶液色谱图中如有杂质峰，用自身对照法计算杂质的含量。
2 结果
2.1专属性试验
2.1.1空白干扰试验经过相同处理的空白阴道环提取液的HPLC图谱如图1 所示，在阿那曲唑的保留时间(箭头所示，8.46 min)下无其他的吸收峰出现，说明空白硅橡胶辅料未对阿那曲唑的相关检测产生干扰。
图1 空白阴道环提取液(A)和阿那曲唑阴道环供试品溶液(B)在检测条件下的HPLC图谱
2.1.2强制降解试验结果见图2所示，样品经酸、碱、氧化、高温、光照破坏后，阿那曲唑有轻微降解，但各降解产物峰与主要峰之间均可达到良好分离。
2.2 检测限
由HPLC进样后的结果分析可知， 阿那曲唑的检测限为3 ng/ml。
2.3 精密度试验
阿那曲唑对照品中杂质总和在1日内的RSD为1.3%，表明方法的精密度良好。
2.4 重复性试验
6份供试品溶液中阿那曲中的杂质总和的RSD为1.6%，表明方法的重复性良好。
2.5 溶液稳定性试验
阿那曲唑供试品溶液在24 h内杂质峰面积总和的RSD为1.8% ，表明阿那曲唑的稳定性符合相关要求。
2.6 有关物质检查
3批样品定量测定结果见表1。统计结果显示，所制备的3批样品在阿那曲唑检测条件下单杂质和总杂质含量均低于0.5%，符合药典要求。
表1 阿那曲唑阴道环不同批次杂质检测结果(%)
图2 阴道环中的阿那曲唑在未处理(A)、酸(B)、碱(C)、氧化(D)、高温(E)、光照(F)条件下的HPLC图谱
3 讨论
本研究对2015版药典中阿那曲唑的有关物质的检测方法进行了优化，经过摸索，将原有的乙腈-水(45:55，v/v)调整为乙腈-水(42:58，v/v)，实验结果显示在该比例下，分离效果更好，峰形也更优。
阴道环制剂中，药物均匀分散在硅橡胶辅料中，将药物从硅橡胶中彻底提取存在一定困难，因此对药物的提取方法也进行了优化，考察了超声法、磁力搅拌法及两者结合法，筛选了甲醇、乙腈两种提取溶剂，考察了不同的提取溶剂体积，最终选择室温下，100 ml甲醇，磁力搅拌提取24 h作为药物的提取方法，此方法最为经济、环保、方便。
采用了不加校正因子的主成分自身对照法对阿那曲唑阴道环中的有关物质进行检测。专属性实验结果表明辅料完全不干扰主药的测定；有关物质检查结果表明单杂质和总杂质含量均低于0.5%，也不会对主药的检测结果产生干扰。
本研究考察了提取方法，优化了流动相比例，将HPLC法应用于阿那曲唑阴道环的有关物质的检测，经方法学验证，此法的专属性强，灵敏度高，重复性好，符合相关规定的要求，可以为阿那曲唑阴道环质量标准的制订提供科学依据。
