不同产地黄精多糖含量测定及其体外抗氧化活性研究

何晓梅，李 超，李永忠，李语涵，陈存武

(1.皖西学院 生物与制药工程学院，安徽 六安 237012；2.植物细胞工程安徽省工程技术研究中心，安徽 六安 237012)

黄精(PolygonatumsibiricumRed.)、多花黄精(PolygonatumcyrtonemaHua )与滇黄精(PolygonatumkingianumColl.et Hemsl.)属百合科黄精属多年生草本植物，是中药材黄精的基原植物，被《中国药典》(2015年版一部)收录的我国传统的中药资源，具有药食同源性[1](P307)。研究表明，黄精具有滋润心肺、补中益气、强壮筋骨、延年益寿等作用[2]。黄精成分丰富[3]，而其最主要且研究最多的生物活性物质为黄精多糖，具有抗肿瘤、调节血糖血脂、调节免疫力、抗氧化、抑菌、抗动脉粥样硬化及保护心脑血管等重要功能[4-5]。本研究采用热水浸提法提取黄精多糖，乙醇沉淀得到黄精粗多糖，以不同浓度黄精多糖对DPPH自由基和羟基自由基的清除作用研究其体外抗氧化活性，旨在对黄精的种植及黄精产品的开发提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料和试剂

材料：湖北、湖南、金寨、青阳和河南(黄精品种)5个产地同年份黄精药材，前4个产地品种为多花黄精。药材经皖西学院陈存武教授鉴别为百合科植物黄精属的干燥根茎。经粉碎机粉碎，过筛，置于电热干燥器中干燥，备用。

试剂：无水乙醇、蒽酮、浓硫酸、葡萄糖、水杨酸、硫酸亚铁、30%过氧化氢、DPPH·(1，1-二苯基-2-苦基肼)等试剂，均为国产分析纯。实验用水为双蒸水。

1.2 主要仪器设备

粉碎机(1000克密封型摇摆式粉碎机)、ZMD-2型电子分析天平(上海方瑞仪器有限公司)、恒温水浴箱(常州普天仪器制造有限公司)、SY-2000型旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)、TU1901型紫外分光光度计(上海元析仪器有限公司)，SHZ-D(Ⅲ)型循环水真空泵(上海亚荣生化仪器厂)、电热干燥箱(智能型电热恒温鼓风干燥箱)。

1.3 实验方法

1.3.1 葡萄糖标准曲线的制备

取经105 ℃干燥至恒重的无水葡萄糖对照品1.000 g，置于1000 mL容量瓶中溶解并稀释到刻度，摇匀，即得浓度为1 mg/mL的葡萄糖贮备液。分别取浓度为1 mg/mL的葡萄糖溶液1 mL、2 mL、4 mL、6 mL、8 mL、10 mL于6只100 mL容量瓶中，加水定容到刻度，得到浓度为0.01 mg/mL、0.02 mg/mL、0.04 mg/mL、0.06 mg/mL、0.08 mg/mL、0.10 mg/mL的葡萄糖对照品溶液。依次量取上述对照品溶液1 mL于6只干燥洁净的试管中，在冰水浴中缓慢滴加0.2%(g/mL)蒽酮-硫酸溶液4 mL，混匀置于沸水浴中反应10 min，取出，立即置冰水浴中冷却10 min，取出，以双蒸水为空白对照，根据紫外可见分光光度法测定原理，进行光谱图扫描，找出最大吸收波长，并读出该波长处不同浓度对照品溶液的吸光度，以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，得y=9.5707x-0.0102，R2=0.996，如图1。

图1 葡萄糖标准曲线

1.3.2 黄精多糖的制备

分别取60 ℃干燥至恒重的60目的黄精干粉10 g加入300 mL 80%乙醇置于水浴中回流脱脂脱色，直至滤纸上无油迹和色斑，挥干粉末。然后将上述处理的黄精粉末各加入300 mL蒸馏水，在80 ℃浸提三次，每次2 h，合并提取液，置于旋转蒸发仪真空减压浓缩到300 mL。按体积比1∶4加入无水乙醇，边加入边搅拌，4 ℃醇沉12 h，5000 rpm离心20 min得黄精多糖，依次用乙醚、丙酮和无水乙醇洗涤、离心，干燥，备用[6]。

1.3.3 黄精多糖含量测定及提取率的计算

根据1.3.2的方法，取1 mL提取液，同葡萄糖标准曲线测定方法测定吸光度值，计算多糖提取率。

黄精多糖浓度(mg/mL)=(A584-0.0102)/9.5707

黄精多糖质量(g)=黄精多糖浓度*稀释倍数*黄精多糖溶液总体积*1000

黄精多糖提取率(%)=黄精多糖质量/黄精粉末质量

1.3.4 DPPH清除率测定

DPPH是一种稳定的自由基，其醇溶液呈现深紫色，在517 nm波长处有强吸收，加入抗氧化剂后，517 nm波长处的吸光度减弱。将不同产地黄精多糖配成不同浓度的溶液，吸取2 mL样品于试管中，再加入0.02 mol/L DPPH溶液(无水乙醇配制)充分摇匀，在室温下避光保存30 min，然后在517 nm波长处测定吸光度，并以VC作阳性对照，按下列公式计算各试样对DPPH自由基清除率[7]。

清除率/%=[A2-(A1-A3)]/A2*100%

式中：A1：2 mL多糖溶液+2 mL DPPH的吸光度

A2:2 mL水+2 mL DPPH的吸光度

A3：2 mL多糖溶液+2 mL无水乙醇的吸光度

调零：2 mL水+2 mL无水乙醇

1.3.5 对羟基自由基清除能力的测定

各取7支试管，第1～5管加入1 mL不同浓度多糖样液，0.5 mL 9 mmol/L FeSO4溶液，0.5 mL 9 mmol/L水杨酸溶液，2.5 mL蒸馏水，最后加入0.5 mL 9 mmol/L H2O2溶液启动反应。第6管加入1 mL不同浓度多糖样液，0.5 mL 9 mmol/L FeSO4溶液，0.5 mL 9 mmol/L水杨酸溶液，2.5 mL蒸馏水，0.5 mL蒸馏水。第7管加入1 mL蒸馏水，0.5 mL 9 mmol/L FeSO4溶液，0.5 mL 9 mmol/L水杨酸溶液，2.5 mL蒸馏水，0.5 mL 9 mmol/L H2O2溶液。

在37 ℃条件下反应30 min，在510 nm波长处检测吸光度[8]。按照如下公式，计算清除率：

清除率(%)=[1-(A1-A2)/A3]×100

式中A1为加入不同浓度多糖溶液时的吸光度值，A2为蒸馏水代替H2O2溶液时的吸光度，A3为蒸馏水代替多糖溶液时的吸光度值。

2 结果与分析

2.1 不同产地黄精可溶性多糖得率

表1 不同产地黄精粗多糖提取率

表2 不同产地黄精可溶性多糖得率

从表1可知，湖南的黄精粗多糖提取率最高，为11.93%；其次是河南9.42%，金寨8.71%，青阳8.04%，湖北为6.27%。经过紫外分光光度法测定，由表2可知，金寨的可溶性多糖得率最高，为6.360%，其次分别为湖南5.847%、青阳4.181%、河南2.732%、湖北1.405%。由此可见，通过1.3.2方法制备的醇沉黄精粗多糖，溶解后，通过蒽酮-硫酸比色法测定其可溶性多糖含量表明，每种黄精含有的可溶性多糖得率不同，金寨产黄精可溶性多糖含量最高。

2.2 不同产地黄精多糖对DPPH清除率的测定

由图2可知，不同产地黄精粗多糖对DPPH清除率与其浓度呈一定的剂量关系，且随多糖浓度的增加，清除率逐渐增大。在实验研究的浓度范围内，湖北黄精多糖对DPPH清除率最优，最大达到98.76%。其次是河南黄精多糖，最大清除率达到91.36%；金寨、湖南和青阳黄精多糖对DPPH清除率依次69.73%、68.74%和56.86%。湖北黄精多糖和河南黄精多糖对DPPH清除率明显优于其他三种。

图2 多糖浓度与DPPH清除率的相关性

2.3 不同产地黄精多糖对羟基自由基清除能力的测定

图3 多糖浓度与羟基自由基清除率的相关性

由图3可知，在实验研究的浓度范围内，不同产地黄精粗多糖对羟基自由基清除率随浓度的增加而增大。湖南产地黄精多糖对羟基自由基清除率效果最优，最高达到97.43%。湖北与河南产地黄精多糖对羟基自由基清除率较为接近，依次为83.98%和82.57%。金寨黄精多糖对羟基自由基清除率最高达到75.83%。青阳黄精多糖对羟基自由基清除率最差。

3 结论

湖南黄精、河南黄精、金寨黄精、青阳黄精、湖北黄精粗多糖得率依次为11.932%、9.421%、8.712%、8.040%、6.269%；金寨黄精、湖南黄精、青阳黄精、河南黄精、湖北黄精可溶性多糖得率依次为6.360%、5.847%、4.181%、2.732%、1.405%；醇沉粗多糖得率和水溶性多糖得率不成对应关系，可能与不同黄精多糖的成分和结构有关。

湖南黄精、河南黄精、金寨黄精、青阳黄精、湖北黄精粗多糖对DPPH自由基和羟基自由基均有不同程度的清除作用，且呈一定的剂量关系。在试验研究的浓度范围内，湖北黄精粗多糖对DPPH自由基的清除作用最强；湖南黄精粗多糖对羟基自由基清除能力最强。实验结果表明5个产地黄精粗多糖对DPPH自由基和羟基自由基清除能力不具有一致性，有待进一步研究。