一测多评法测定白芍中的五种成分含量

周光姣，白 华，权春梅，汪盈盈,黄 翔

(1.安徽中医药科学院 亳州中医药研究所，安徽 亳州 230031；2.亳州职业技术学院，安徽 亳州 236800)

中药化学成分众多、复杂，且中医药理论强调成分的整体协同作用，故对药材及其制剂的质量评价慢慢由单一成分评价转向多指标、整体性评价。一测多评法(QAMS)是利用样品中物质含量与检测信号响应值的比例关系，选择并测定一个成分，以该成分作为内参物，通过方法学考察，建立内参物与其他物质间的检测响应值比例关系即相对校正因子，利用相对校正因子换算其他物质的含量，实现对其中多个成分含量的测定[1-3]。一测多评法可以实现多种成分的同步测定，提高工作效率，还可以解决缺乏对照品的问题，能够最大限度降低检验成本。

白芍为毛茛科植物芍药(Paeonia lactiflora Pall)的干燥根，性微寒，味微苦、酸。具有养血调经、柔肝止痛、敛阴止汗等功效，临床上广泛应用[4]。白芍主产于安徽、浙江、四川等地，其中安徽亳州种植面积最大，产量最大，也是白芍的地道产地。目前，对白芍中的化学成分和含量测定方法已研究较多，但运用一测多评法研究、评价白芍的质量相对较少[5]。本课题采用一测多评的质量评价模式，以芍药苷为内参物，利用相对校正因子计算白芍中没食子酸、苯甲酸、苯甲酰芍药苷和芍药内酯苷的含量，以更简单的方法，多指标评价白芍的质量，使其更加合理、可行。

1 仪器设备与材料

1.1 仪器设备

Agilent1260型高效液相色谱仪(美国安捷伦科技有限公司)；Agilent ChemStation工作站；岛津 LC-20A 高效液相色谱仪，Lab solution工作站；Thermo ODS C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)、安捷伦ZORBAXSBC18(4.6×250 mm，5 μm)色谱柱；FA2204电子天平(常州市幸运电子设备有限公司)等。

1.2 材料

样品：实验用药材样品为课题组成员分别从安徽、浙江、四川白芍主产区采集，经亳州职业技术学院药学院陈娜副教授鉴定为毛茛科植物芍药(Paeonia lactiflora Pall)的根。具体信息见表1。

对照品：没食子酸对照品(批号：1110831-201204))、芍药苷对照品(批号：110736-201640)、苯甲酸对照品(批号：100419-201502)，购自中国药品生物制品研究院；芍药内酯苷对照品(批号：17022404)、苯甲酰芍药苷对照品(批号：20140419)购自成都普菲德生物技术有限公司。

试剂：甲醇、乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 HPLC色谱条件

采用安捷伦ZORBAXSBC18(4.6×250 mm，5 μm)色谱柱，以乙腈(A)-0.1%磷酸水(B)为流动相，梯度洗脱，洗脱程序见表2。进样量10 μL，柱温28 ℃，流速1.0 ml/min，检测波长为230 nm。

表1 药材样品信息表(n=6)

表2 洗脱程序

此色谱条件下没食子酸、苯甲酰芍药苷、芍药苷、芍药内酯苷和苯甲酸分离效果较好，理论塔板数不低于4000。结果见图1。

2.2 样品溶液的制备

称取白芍样品1 g，粉碎过2号筛，精密称定，加入20 mL 70%乙醇回流提取2次，每次2 h，合并滤液，70%乙醇定容至100 mL，摇匀，微孔滤膜滤过，即得样品溶液。

2.3 对照品溶液的制备

精密称定芍药内酯苷对照品13.75 mg、芍药苷对照品22.21 mg、苯甲酰芍药苷对照品10.64 mg和苯甲酸对照品6.6 mg、精密移取没食子酸母液(精密称定没食子酸对照品15.88 mg，甲醇溶解并定容至10 mL，摇匀作为没食子酸母液)2.5 mL至50 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度50 mL，得到芍药内酯苷浓度为275 μg/mL、芍药苷浓度为444.2 μg/mL、苯甲酰芍药苷212.8 μg/mL、苯甲酸132 μg/mL、没食子酸浓度为79.4 μg/mL的混合对照品溶液。

2.4 方法学考察

2.4.1 线性关系的考察

精密移取上述混合对照品溶液0.5 mL、1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL分别至10 mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，制成不同浓度的对照品溶液。按2.1项下色谱条件，分别进样，记录峰面积。以对照品的质量浓度(X)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标，线性回归，得回归方程见表3。

1.没食子酸 2.芍药内酯苷 3.芍药苷 4.苯甲酸 5.苯甲酰芍药苷图1 白芍样品和混合对照品的HPLC图

成分回归方程r线性范围μg/mL没食子酸y=19.018x+45.5220.99983.97～39.7芍药苷y=3.4082x+37.8910.999622.21～222.1芍药内酯苷y=1.8036x+25.2480.9998 13.75～137.5苯甲酰芍药苷y=4.6754x-10.0720.9994 10.64～106.4苯甲酸y=25.378x+15.142 0.99966.6～66

2.4.2 精密度实验

称取安徽亳州十八里镇白芍样品1.0 g，按分2.2项下制备样品溶液，精密吸取样品溶液10 μL。按上述色谱条件，进样，测定峰面积，重复6次。分别记录没食子酸、芍药内酯苷、苯甲酸、苯甲酰芍药苷和芍药苷的6次峰面积，计算其RSD分别为1.32%、1.78%、1.41%、0.93%、1.48%，结果表明所使用设备精密度较好。

2.4.3 重复性实验

分别取安徽亳州十八里镇的白芍样品6份，按2.2项下制备样品溶液，按上述色谱条件，测定苯甲酰芍药苷、苯甲酸、芍药内酯苷、芍药苷和没食子酸的含量，计算RSD分别为1.21%、1.58%、1.31%、0.98%、1.07%，均小于2%，表示该方法重复性较好。

2.4.4 稳定性实验

取十八里镇的白芍样品按2.2项下制备样品溶液，按上述色谱条件，分别于0、3、6、9、12、18、24、48h进样。记录苯甲酰芍药苷、芍药苷、苯甲酸、芍药内酯苷和没食子酸的峰面积，算得RSD分别为1.19%、0.82%、1.22%、1.81%、1.73%，均小于2%，表明样品溶液在48 h内能够稳定存在。

2.4.5 加样回收率实验

取已知样品含量的白芍样品6份(苯甲酸芍药苷含量为0.138%、没食子酸含量为0.279%、苯甲酸含量为0.117%、芍药苷含量为1.615%、芍药内酯苷含量为0.549%)，粉碎，过2号筛，每份取0.5 g，精密称定，分别按80%、100%、120% 三个水平，加入苯甲酸、芍药苷、芍药内酯苷、苯甲酰芍药苷和没食子酸5种对照品。按2.2项下制备样品溶液，按上述色谱条件测定含量，计算加样回收率。结果苯甲酸芍药苷、没食子酸、苯甲酸、芍药苷和芍药内酯苷苷的加样回收率分别为101.5%、100. 4%、98.84%、99.27%和101.2%，RSD值分别为1.89%、1.72%、1.28%、0.84%和1.06%。

2.4.6 相对校正因子(RCF)和相对保留时间(RRT)的测定

取“2.2”项下混合对照品溶液1 mL,至10 mL容量瓶中，甲醇稀释至刻度，分别吸取10、20、30、40、50 μL按“2. 1”项下色谱条件进样，测定没食子酸、芍药苷、芍药内酯苷、苯甲酸和苯甲酰芍药苷峰面积。以芍药苷为内参物，计算没食子酸(X1)、芍药内酯苷(X2)、苯甲酸(X3)和苯甲酰芍药苷(X4)的相对校正因子(RCF)和相对保留时间(RRT)，结果见表4。表明使用不同色谱柱和不同高效液相色谱仪，各成分相对于芍药苷的 RCF 值和 RRT 值的 RSD 均小于 5.0%，说明该方法重现性较好。

表4 白芍药材中 4种成分的RCF和RRT(n=3)

2.5 QAMS法和外标法5种成分含量测定结果和比较

分别取白芍样品约1g，粉碎，过2号筛，精密称定。分别按2.2项制备方法制备样品溶液，按2.1项下色谱条件进样分析，采用外标法和QAMS算出各白芍药材中5种含量，结果见表5。

结果表明：QAMS法和外标法测定各批样品中没食子酸、芍药苷、芍药内酯苷、苯甲酰芍药苷和苯甲酸5种成分含量结果相对误差很小，均小于5%，表明两种方法所测得含量无显著差异。

3 讨论

从表3方法耐用性考察结果可以看出，内参物芍药苷与没食子酸、芍药内酯苷、苯甲酰芍药苷和苯甲酸4种成分之间的相对校正因子重现性良好，说明QAMS法用于测定亳白芍中的5种成分，系统适用性强，方法具有可行性和可靠性。

白芍样品的制备时，预实验是分别摸索了回流提取和超声提取两种方法，并筛选了提取溶媒，结果发现超声提取较回流提取工艺简单，节省时间和耗材，但所得提取液相色谱出峰数多、分离度不好，故选择回流提取。在选择40%、70%和80%三个浓度的乙醇做提取溶剂时，实验发现40%乙醇5种成分的含量都偏低，70%、80%的乙醇，结果差异不大，但从节省资源的角度，优选70%的乙醇做最后的提取溶剂。

表5 QAMS法和外标法测定药亳白芍材中5种成分含量结果及比较(%，n=3)

白芍药材5种成分检测，一测多评法代替传统的外标法，在没食子酸、芍药内酯苷、苯甲酰芍药苷和苯甲酸对照品缺乏的情况下可以实现多成分的检测，同时还节约了检测成本，值得推广应用。