松乳菇子实体人工诱导方法研究

詹少华

(皖西学院 生物与制药工程学院，安徽 六安 237012)

松乳菇lactariusdelicious属于红菇科、乳菇属，安徽本地俗称该食用菌为雁来菇或松菇，目前市场上的松乳菇都是采集于野外，松乳菇味道鲜美独特，市场上价格较高，鲜菇每公斤100元左右，松乳菇季节性较强，安徽省主要在每年的初秋上市。松乳菇营养丰富，蛋白质的含量在20%以上，粗脂肪和糖类的含量品种间差异较大，脂类和总糖含量分别可达20%和15%，各类微量元素较为丰富，尤其是钙、铁、锌、铜、锰含量较高。松乳菇的谷氨酸、天冬氨酸含量较高，这与松乳菇的独特鲜味有关[1-2]。松乳菇具有很强的保健功效，松乳菇多糖具有抗肿瘤和抗炎作用[3-4]，松乳菇含有愈创木烷倍半萜类化合物，能够清除细胞毒素和抗菌活性[5]。

松乳菇人工栽培具有较大的经济价值，但是松乳菇完全人工栽培目前中外尚未见可信的报道。松乳菇的母种和原种制备并不困难，常见的PDA培养基就可以培养松乳菇母种和原种，麦芽糖、葡萄糖和淀粉作碳源松乳菇的菌丝都可以很好的生长[6]，维生素B1、赤霉素、三十烷醇和肌醇等物质可以促进松乳菇菌丝的生长[7]。半固体培养基松乳菇菌丝生长速度较快，可以得到棕黄色的菌丝，且可以观察到类似子实体原基的菌丝团[8]。松乳菇在马尾松林下半人工栽培效果并不理想，出菇数量很少[9]，松乳菇人工栽培困难较大，这与松乳菇属于马尾松等植物外生菌根类真菌有关[10]，人工栽培条件下，菌丝不能从松树上获得某类活性物质[11]。

松乳菇人工栽培是一个诱人的课题，这不仅仅是松乳菇营养价值高，经济效益前景可观，更重要的是为其他外生菌根菌的人工驯化提供可行性的方法，同时对研究外生菌根菌的子实体形成机理提供理论依据。近年来，本实验室利用固体发酵原理，在培养基的成分、培养条件，尤其在培养方式方面不断尝试，成功诱导出松乳菇的子实体，报道如下。

1 试验材料与方法

1.1 菌丝扩繁培养基配方

菌丝扩繁培养基配方1：蔗糖5 g、淀粉15 g、蛋白胨2 g、磷酸二氢钾0.02 g、硫酸镁0.01 g、氯化钠0.5 g 、VB10.001 g、琼脂9 g，总体积1000 ml，配制方法见参考文献[4]。

菌丝扩繁培养基配方2：各营养成分同配方1，杂树叶代替琼脂，杂树叶剪成不超过1 cm×1 cm大小，杂树叶清水中浸泡2 h，沥干1 h，然后依次拌入各营养成分，杂树叶总体积1000 ml。杂树叶来源于皖西学院校园内各类阔叶类树叶。

菌丝扩繁培养基配方3：各营养成分同配方1，小树枝代替琼脂，小树枝剪成0.5 cm×0.5 cm ×0.5 cm大小，小树枝清水中浸泡2 h，沥干1 h，然后依次拌入各营养成分，小树枝总体积1000 ml。小树枝来源于皖西学院校园内各类阔叶类植物。

1.2 子实体诱导培养基

子实体诱导培养基配方1(g/g)：托盘为20 cm×20 cm×20 cm塑料框，杂树叶70%、棉籽壳20%、玉米粉3%、豆粕5%、蔗糖1.5%、碳酸钙0.5%，自然pH。配制方法：杂树叶清水中浸泡2 h，沥干1 h，依次加入上述成分，混匀，培养基填满整个托盘。

子实体诱导培养基配方2：托盘为20 cm×20 cm×20 cm塑料框，杂树叶用水充分浸泡2 h，然后沥干1 h，托盘中铺垫5 cm厚的杂树叶→加入上述配方1培养基10 cm→杂树叶填满托盘；

子实体诱导培养基配方3：托盘中间部分填充10 cm×10 cm×20 cm配方1培养基，其余部分填充杂树叶；

子实体诱导培养基配方配方4：托盘中间部分填充10 cm×10 cm×20 cm杂树叶，，其余部分填充配方1培养基。

1.3 子实体诱导培养条件及方法

栽培种的接种量按照培养基总量的1/10(v/v)，子实体诱导培养基中的杂树叶不接种菌种，栽培种接种后，28 ℃、湿度70%避光培养30 d，再17 ℃、湿度80%散射光继续培养10 d，观察子实体诱导效果。

1.4 补料培养方法

子实体诱导成功后，在培养基上方滴加营养液10 ml，湿度60%、17 ℃培养2 d，然后再湿度85%、17 ℃培养10 d，观察子实体发育状况。

表1 补料营养液配方(1000 ml)

2 结果与分析

2.1 不同菌丝扩繁培养基的子实体诱导效果

表2是三种不同的菌丝扩繁培养基，分别接种到子实体诱导培养基选用配方3中，因为直径数毫米的子实体太多，难以准确计数，且目测的方法也难以与一般的菌丝团相鉴别，所以只将子实体高度达到1 cm以上的用于计数和分析。子实体有呈现单个生长，也有簇生呈菊花状生长(图2)，颜色具有纯白色、淡黄色或棕色。利用菌丝扩繁培养基配方1进行接种，没有发现菊花状的子实体，菌丝扩繁培养基配方2和配方3的子实体数量较多，但是多个子实体簇生呈菊花状，这种菊花状的子实体存活2天后逐渐枯萎。总体来看，菌丝扩繁培养基配方1是三种培养基中最理想的培养基。

表2 不同菌丝扩繁培养基的子实体诱导效果

图1 子实体诱导培养基配方3中生长的子实体

图2 子实体簇生呈菊花状

2.2 三种子实体诱导培养基对松乳菇生长的影响

菌丝扩繁培养基选用配方1，分别接种到三种不同的子实体诱导培养基中，子实体高度达到1 cm以上的用于计数和分析。从子实体数量来看，如图3所示，子实体诱导培养基配方4生长的子实体最多，但是菌盖较小，菌柄较长，这种子实体继续培养，存活2天后枯萎。子实体诱导培养基配方2和配方3培养的松乳菇，菌盖较大，菌柄较短，继续培养可以5天以上，子实体诱导培养基配方1生长的子实体，子实体数量少且细长，总体来看子实体诱导培养基配方3是最理想的培养基。

表3 三种子实体诱导培养基对松乳菇子实体诱导效果的影响

2.3 补料营养液对松乳菇子实体发育的影响

菌丝扩繁培养基选用配方1，子实体诱导培养基选用配方3，5种补料营养液的区别在于蛋白胨含量的区别，也就是碳氮比的不同。表4表明，各种补料营养液都可以提高子实体的成活率，补料营养液配方4对原有子实体的生长作用最理想，主要表现为无衰退子实体比例最高，同时菌柄较短，菌盖较大，子实体的颜色接近野生松乳菇的颜色。补料培养过程中，补料营养液配方3更有利于新子实体的产生。

图3 子实体诱导培养基配方4生长的子实体

对照配方1配方2配方3配方4配方5原有子实体无衰退的比例/%2.76.317.223.535.631.3颜色淡黄色淡黄色淡黄色棕黄色棕黄色棕黄色菌柄长度/cm3.73.63.12.82.61.9菌盖直径/cm1.21.31.71.92.32.1新生子实体数量/个813271276756颜色淡黄色淡黄色淡黄色棕黄色棕黄色棕黄色菌柄长度/cm3.73.62.80.91.71.9菌盖直径/cm0.40.40.50.80.50.7

图4 补料培养得到的松乳菇子实体

3 讨论

本试验表明松乳菇在完全脱离松树环境下，在实验室里可以诱导出松乳菇的子实体，这说明松乳菇人工栽培完全可行，以前未发现这方面可信的报道，方平夷采用棉籽壳培养基[12]，室内自然条件下培养，该文献报道说观察到了松乳菇的子实体，从该文的子实体诱导培养基配方来看，棉籽壳90%，腐烂茅草8%，蔗糖2%，该培养基无水分，本实验室重复该实验，发现该培养基连松乳菇的菌丝都不能生长，该实验没有对松乳菇培养的湿度进行控制，任何食用菌都难以形成子实体。

菌丝扩繁培养基是一种半固体培养基，半固体培养基作为菌丝扩繁培养基是诱导松乳菇子实体的关键因素之一，而其他培养基培养松乳菇菌丝时，往往产生较多的菌丝分泌物，这些分泌物又抑制了菌丝进一步的生长和分化。

子实体诱导培养基的设计依据来源于我们对野生松乳菇生长环境的观察，在野生条件下，松乳菇生长在杂树叶的腐质土环境中，松乳菇可以利用杂树叶作为碳源，所以子实体诱导培养基是以杂树叶为主要原料，同时在子实体培养基添加豆粕等原料补充氮源。杂树叶在子实体诱导方面起到了重要作用，子实体诱导培养基配方3是最理想的培养基，这与该培养基中四周具有杂树叶覆盖有关，松乳菇菌丝生长具有攀爬支持物的特点，这样菌丝可以生长更长，产生更多的分支，杂树叶之间的空隙菌丝生长密集，有利于菌丝之间扭结到一起产生子实体原基，松乳菇的原基多数生长在杂树叶上，尤其是在叶脉处松乳菇的原基较多，杂树叶还有保湿作用，提供菌丝生长和产生原基的微环境。

补料培养有利于子实体的继续发育，这可能是因为补料培养提供了新的营养液，但是我们观察发现，子实体形成时，培养基中的豆粕等物质还大量存在，培养基中的营养物质还有很多没有被消耗，补充新的营养液，促进子实体的生长，还可能因为补料营养液改变了培养基的酸碱度等因素。本试验补料培养研究表明，松乳菇的子实体形成和子实体进一步发育可能需要不同的培养基，这是在其他食用菌栽培过程中没有发现的现象。

本试验得到的松乳菇子实体菌盖最大直径约4 cm，而野生的松乳菇菌盖直径可达到10 cm以上，这说明松乳菇人工栽培尚需进一步探索，下一步研究的重点是松乳菇子实体不同发育阶段的培养基和培养条件。