乙酸钠通过抑制过度炎症反应保护乙醇诱导的小鼠胃黏膜损伤

施伊露，张佳丽，乔莞宁，陈洁，苏炜，张铮铮，董人杰，王方岩，黄颖鹏

（1.温州医科大学 基础医学院，浙江 温州 325035；2.温州医科大学附属第二医院育英儿童医院 胃肠外科，浙江 温州 325027）

胃黏膜损伤是一种常见的消化系统病变，主要症状有上腹部疼痛、食欲减退、恶心呕吐、反酸腹泻等，且伴有上消化道出血、溃疡穿孔、幽门梗塞等并发症，甚至会引起癌变[1-2]。导致胃黏膜损伤的因素很多，如过量饮酒、应激、长期服用非甾体类抗炎药物、幽门螺杆菌感染等。但现有的药物对胃黏膜损伤的疗效不甚理想，探索新的防治胃黏膜损伤的措施有着重要意义。

炎症是造成胃黏膜损伤的重要因素。由于前列腺素在黏膜屏障中的重要作用和地位，常规用于抑制炎症的非甾体类抗炎药物反而会造成胃黏膜的损伤[3]。目前，临床上缺乏针对胃黏膜炎症的有效治疗手段。乙酸属于短链脂肪酸（short chain fatty acids，SCFAs），具有维持水电解质平衡、抗病原微生物和抗炎[4-5]、抗肿瘤[6]以及调控基因表达的作用[7]。在能量代谢方面，乙酸能够降低肥胖的发生率[8]，降低血浆游离脂肪酸（free fatty acids，FFA）浓度，还能通过改善胰岛素灵敏度[9-12]来预防I I型糖尿病。有研究报道SCFAs对肠道疾病有防治作用[13]，因此，我们认为乙酸很有可能对胃黏膜损伤具有潜在的疗效。本研究以乙醇刺激复制小鼠胃黏膜损伤模型，利用乙酸钠进行干预，探究乙酸钠对胃黏膜炎症的影响，同时也为胃黏膜损伤防治的进一步研究以及乙酸钠药用价值的开发提供借鉴和参考。

1 材料和方法

1.1 材料 GES-1和J774细胞系购于美国模式培养物集存库。乙酸钠（CAT：791741）、LPS（CAT：2880）购于美国Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 实验分组及建模：健康雄性ICR小鼠（SPF级），体质量20～25 g，由温州医科大学实验动物中心提供[SYXY（浙）2009-0129]。随机分为正常对照组、模型组和乙酸钠组，每组9只，用苦味酸分别编号后将各组小鼠饥饿处理24 h（禁食不禁水），给乙酸钠组和模型组小鼠分别灌胃乙酸钠溶液（3.5 g/kg）和pH 9.5的NaHCO3溶液，剂量为0.1 mL/10 g，正常对照组不做处理。各组给药30 min后，用乙醇灌胃进行急性胃黏膜损伤造模。乙醇灌胃1 h后，用颈椎脱臼法处死小鼠。剪取胃组织，将标本分为两部分。一部分放入液氮中，另一部分则浸入4%多聚甲醛中固定，以备后续检测。

1.2.2 胃溃疡面积的计算：对胃组织进行胃黏膜面色泽，有无糜烂、溃疡等典型变化的肉眼观察，并立即拍照，获得的图像再用软件Image-Pro Plus（IPP）6.0测量胃组织的总面积及出血溃疡面，并计算二者的相对面积比例。

1.2.3 离体细胞培养：人正常胃黏膜细胞株GES-1和小鼠巨噬细胞系J774于含10% FBS的1640培养基中，在恒温培养箱中以5% CO2、37 ℃及饱和湿度条件下培养传代。每2～3 d换液1次，细胞生长＞80%并覆盖培养瓶底，进行传代，1000 r/min离心5 min后，按1∶3分至新的培养瓶中培养，待用。

1.2.4 乙醇诱导GES-1损伤模型及乙酸钠干预及分组：利用8%的乙醇对GES-1进行损伤刺激4 h[14]，并同时给予不同浓度的乙酸钠干预，实验分组如下：正常组、乙醇组、乙醇+10 μmol/L乙酸钠组、乙醇+100 μmol/L乙酸钠组和乙醇+1 mmol/L乙酸钠组。刺激结束后，通过CCK-8试剂盒对细胞的活力进行检测。

1.2.5 LPS诱导炎症模型及乙酸钠干预及分组：以100 ng/mL LPS刺激J774细胞系诱导炎症反应1 h，并同时利用不同浓度的乙酸钠进行干预，实验分组如下：正常组、LPS组、LPS+10 μmol/L乙酸钠组、LPS+100 μmol/L乙酸钠组和LPS+1 mmol/L乙酸钠组。实验结束后，收集细胞用于细胞因子检测。

1.2.6 RT-qPCR测定炎症因子：取适量标本，加入1 mL Trizol试剂后充分匀浆，常规操作提取总RNA。使用核酸蛋白分析仪检测RNA浓度及纯度。按照反转录试剂盒（北京天根生化科技有限公司，KT201）说明书合成样品cDNA。以合成的cDNA为模板，按荧光定量PCR试剂盒（大连TaKaRa公司，RR820A）说明书进行PCR扩增。引物序列见表1。反应条件为：95 ℃预变性30 s，95 ℃变性5 s，60 ℃退火30 s后采集荧光信号，重复40个循环。

1.3 统计学处理方法 采用SPSS18.0统计软件进行统计分析。计量资料以±s表示，各组间数据比较采用单因素方差分析，方差齐性则采用Bonferroni法，方差不齐者用Dunnet’sT3法。P＜0.05为差异有统计学意义。

表1 PCR引物序列

2 结果

2.1 乙酸钠对乙醇诱导胃黏膜损伤的保护作用 正常对照组：胃黏膜皱裂有序，黏膜色淡粉红，表面光滑，无溃疡、糜烂、充血、水肿；模型组：胃黏膜片块坏死脱落，充血水肿，形成溃疡；乙酸钠组：胃黏膜层可见斑点状损伤，损伤面积较小且表面比模型组光滑。通过对溃疡面积的计算并进行组间比较发现，模型组的溃疡较为明显，但乙酸钠能够显著改善乙醇造成的胃黏膜损伤，见图1。这些结果表明，乙酸钠对乙醇诱导的胃黏膜损伤具有保护作用。

图13组胃黏膜溃疡面积比较

2.2 乙酸钠抑制乙醇诱导的急性胃溃疡炎症反应 与模型组相比，乙酸钠处理能明显降低乙醇诱导引起的小鼠胃组织IL-1β、TNFα和MCP-1升高（P＜0.01），见图2。

图2 乙酸钠对胃黏膜炎症因子mRNA表达的影响

2.3 乙酸钠对乙醇诱导的GES-1细胞损伤的保护作用 经8%的乙醇刺激4 h后，模型组的细胞增殖率与正常对照组相比明显降低；但在不同浓度的乙酸钠的干预下，细胞活力较模型组明显升高（P＜0.01）。见图3。

2.4 乙酸钠抑制LPS诱导J774细胞引起的炎症反应 LPS刺激J774细胞1 h，IL-1β、TNFα和MCP-1表达水平较正常组显著上调（P＜0.01）。但不同剂量的乙酸钠处理后，各炎症因子的表达量受到显著的抑制（P＜0.01），而各剂量组之间差异无统计学意义（P＞0.05）。见图4。

3 讨论

本研究采用乙醇为刺激因素复制小鼠急性胃黏膜损伤模型来探究乙酸钠对胃黏膜的保护作用[15]。在正常情况下，胃攻击因子与防御因子处于一种平衡状态，胃黏膜可以抵抗胃酸和胃蛋白酶的攻击。通过乙醇的强烈刺激，导致攻击因子与防御因子失衡，一方面乙醇直接损伤胃黏膜，另一方面由于胃黏膜的损伤导致胃酸和胃蛋白酶对胃黏膜的攻击，造成急性的胃黏膜损伤[16]。该模型能够很好地模拟过量饮酒造成的急性胃黏膜损伤，也是筛选胃黏膜防治药物的首选模型。

图3 不同浓度乙酸钠对乙醇所致GES-1细胞损伤的影响

在对胃的大体观测中发现乙醇造成胃黏膜的严重损伤，呈现大面积的出血糜烂，而在使用乙酸钠后胃黏膜得到很好的保护。由于乙酸钠呈碱性，其保护作用可能是由于中和了胃酸导致的，我们在模型组给予了相关pH值的NaHCO3，但并未观测到任何保护作用，所以，乙酸钠的保护作用与其呈碱性特性无关。

在正常人胃黏膜细胞株上，我们发现各浓度的乙酸钠均可以拮抗乙醇造成的GES-1损伤，而且以低浓度为著。乙酸作为二碳的短链脂肪酸，是肠道黏膜主要能源之一，对肠黏膜细胞的损伤也具有保护作用[17]。胃黏膜与肠黏膜具有较高的同源性。我们的数据证实了我们的假设即乙酸钠对胃黏膜具有直接的保护作用。

图4 乙酸钠抑制LPS诱导的J774巨噬细胞炎症反应

炎症在胃黏膜损伤的发病机制中具有重要的作用。已有大量文献报道，促炎症因子IL-1β和TNFα参与乙醇介导的胃黏膜损伤[18]。研究发现在乙醇诱导的胃黏膜损伤中，MCP-1的表达水平显著提高，该结果提示MCP-1作为重要的趋化因子，在胃黏膜的损伤机制中也具有重要的地位[19]。以往研究表明，通过具有抗炎作用的化合物干预能够减轻乙醇诱导的胃黏膜损伤[20]。本研究中，我们通过RT-qPCR的方法检测了IL-1β、TNFα和MCP-1的表达水平。结果表明，乙醇刺激能够诱导胃黏膜中上述炎症因子的表达水平显著提高，而乙酸钠能够显著减低上述因子的表达。有研究发现乙酸对炎症具有显著的抑制作用，能够调控免疫细胞的功能，减轻炎症性肠病（inflammation bowl diseases，IBD）[21]。我们通过LPS诱导小鼠巨噬细胞株的炎症反应为模型，发现不同剂量的乙酸钠均能显著抑制LPS诱导的炎症反应，而且各剂量组之间无差异。该结果提示乙酸作为常见的短链脂肪酸具有较宽的剂量适应性，能够在10 μmol/L～1 mmol/L的范围内发挥稳定的抗炎效应。离体实验的数据更为充分地证实乙酸钠抑制炎症反应的作用是其抗胃黏膜损伤的重要机制。乙酸作为一种重要的短链脂肪酸，是肠道微生物的重要代谢产物，能够抑制肠道肿瘤，调节肠道的免疫机能，抑制肠道内的炎症反应。我们的研究则证实乙酸钠能够抑制乙醇诱导的胃黏膜炎症反应，保护胃黏膜。但是，具体分子机制仍有待进一步研究。