子宫内膜异位症细胞表面特异性结合肽的筛选

颜林志，曹丹，王乐丹，李文桔，吕杰强

（温州医科大学附属第二医院 妇产科，浙江 温州 325027）

子宫内膜异位症是育龄期妇女常见的一种良性疾病，但是它的一些生物学行为和恶性肿瘤相类似。近年来，肿瘤靶向治疗是肿瘤临床治疗的热点之一，而在子宫内膜异位症的治疗中尚没有特异性的药物能到达病灶局部并形成有效的杀伤浓度，因此子宫内膜异位症的靶向治疗将成为解决这一问题的重要手段。噬菌体展示技术被认为是筛选肿瘤细胞表面特异性结合肽的一种生物学技术[1]，目前已被广泛应用于肿瘤抗原筛选、单克隆抗体制备等[2-3]，为研究子宫内膜异位症的靶向治疗提供了新的方法。本研究在噬菌体展示基础上，以子宫内膜异位症患者的异位内膜为靶标，通过噬菌体展示的随机7肽库筛选子宫内膜异位症特异性结合多肽，鉴定筛选的阳性噬菌体的亲和性及特异性，并分析这些多肽的氨基酸序列，为研究多肽在子宫内膜异位症的早期诊断和治疗方面提供研究资料。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 试剂：噬菌体随机7肽库购自美国New England Biolabs公司，文库滴度为2×1013pfu/mL，随机多样性为1.28×109，大肠杆菌ER2738购自北京Biovector生物技术有限公司，HRP-抗M13单抗及M13K07购自上海生工生物工程有限公司，鼠抗人细胞角蛋白19抗体购自北京中杉金桥公司，IV型胶原酶、DNasel及DMEM/F-12购自美国Gibco公司，邻苯二甲酸二丁酯与环己烷购自北京益强生科技有限公司。

1.1.2 标本：本研究入选2016年1月至6月在温州医科大学附属第二医院住院的子宫内膜异位症IIIIV期（按美国AFS分类）的育龄期女性。共有10位经手术和组织学确诊为子宫内膜异位症的患者入选。所有的在位/异位内膜标本均在增殖期通过诊断性刮宫/腹腔镜下囊肿剔除术获得，分为2组：异位内膜组（n=10）和在位内膜组（n=10，来自同组的同个患者），患者在术前6个月内未接受过如GnRH-a或性激素等的激素治疗。本研究经本院医学伦理委员会审核批准。

1.2 方法

1.2.1 细胞来源：组织在无菌条件下获取后，用乳酸林格液湿润，再用PBS液清洗3～5次，立即低温储存在液氮中。组织融化后经PBS液洗涤2次，剪碎至1 mm3，1 mg/mL的IV型胶原酶于水浴摇床消化1 h，然后加入DNase1（15 U/mL）继续消化30 min，消化液分别经过100目和400目筛网，滤液4 ℃、800×g离心5 min，沉淀细胞即为子宫内膜间质细胞。细胞再用含15% FBS的DMEM/F-12重悬，于37 ℃、5%CO2培养箱中培养和传代。应用玻片法，加鼠抗人细胞角蛋白19抗体进行免疫组织化学染色，鉴定子宫内膜间质细胞的纯度。

1.2.2 差减筛选：收集子宫内膜间质细胞，重悬于1% BSA的DMEM无血清培养液，调整细胞数为1×107/mL。取100 μL在位内膜间质细胞，加入噬菌体随机7肽库10 μL于4 ℃孵育2 h。将细胞和噬菌体的混悬液加在200 μL邻苯二甲酸二丁酯与环己烷组成的有机分离液上，10000×g、4 ℃离心10 min。吸出水相里未结合的噬菌体肽库与100 μL异位内膜间质细胞于4 ℃孵育3 h离心。取出有机相内沉淀物，其为能与异位内膜间质细胞结合的噬菌体，转移沉淀物至新的EP管中，加入200 μL处于对数生长期的大肠杆菌ER2738，37 ℃孵育30 min，复苏与异位内膜间质细胞结合的噬菌体。对淘洗后的噬菌体进行测滴度、扩增、纯化，进入下一轮差减筛选，计数每一轮淘洗和扩增后的噬菌体数目。如此重复5个循环，测定每一轮淘洗和扩增后的滴度。

1.2.3 ELISA：经过5轮生物淘洗后，随机挑选50个蓝斑进行阳性噬菌体克隆的鉴别，每个噬菌体克隆一式三份进行ELISA实验。将细胞（异位/在位内膜间质细胞）以104/孔接种入96孔板，过夜培养，无血清培养1 h；4%多聚甲醛室温固定20 min；封闭液封闭2 h；分别加入上述50个阳性噬菌体克隆（1010pfu/孔），阴性对照PBS和M13K07，37 ℃孵育2 h；加入HRP-抗M13单抗以1∶6000稀释于封闭液中，室温孵2 h；最后加入200 μL/孔的TMB显色液，使用微板阅读器设置在450 nm。

1.2.4 DNA测序和BLAST匹配：经过ELISA实验，OD450值大于0.5的共有13个噬菌体克隆被鉴别，提取这些噬菌体DNA，由上海Sangon Biotech有限公司进行测序分析，通过DNA测序结果推导出多肽序列。通过网络数据库进行BLAST匹配分析。

1.2.5 噬菌体竞争抑制实验：将异位内膜间质细胞以104/孔接种入96孔板，过夜培养后；无血清培养1 h；然后用封闭液37 ℃封闭2 h；PBS系列稀释（0、0.1、1、10、100、1000 nmol/L）合成的多肽RTRLHTR，并与细胞4 ℃孵育1 h，再与2×1011pfu噬菌体P5于4 ℃继续孵育1 h，加入HRP-抗M13单抗以1∶6000稀释于封闭液中，室温孵2 h；最后加入200 μL/孔的TMB显色液，使用微板阅读器设置在450 nm。以肽库中无关噬菌体编码的非特异性多肽作为阴性对照，实验重复3次。

1.3 统计学处理方法 数据采用SPSS20.0统计学软件进行分析，计量资料以±s表示，组间比较采用t检验，多组比较采用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 差减筛选 本研究经过5轮差减筛选，产出噬菌体的数量（106pfu/mL）在研究1、2、3、4、5中分别为0.9±0.2，3.3±0.6，8.2±1.2，14.2±1.2及26.9±1.9，两两比较差异均有统计学意义（P＜0.05）。研究5中生物淘洗的浓度是研究1中的30倍。

2.2 ELISA 在实验中OD450值大于0.5的共有13个噬菌体克隆被选择，这13个子宫内膜异位症相关的克隆其OD450值分别为0.61±0.05，0.63±0.04，0.56±0.05，0.72±0.06，0.58±0.08，0.65±0.03，0.71±0.03，0.58±0.05，0.59±0.02，0.52±0.04，0.66±0.06，0.77±0.05及0.62±0.04，而对照组的OD450值为0.07～0.14，与子宫内膜异位症相关的克隆组比较差异均有统计学意义（P＜0.05），见图1。

2.3 DNA测序 经过ELISA实验，其中OD450值大于0.5的共有13个子宫内膜异位症相关的噬菌体克隆被选出（P2，P5，P9，P11，P14，P17，P22，P24，P31，P34，P37，P45，P46），见表1。提取这些噬菌体DNA，由上海Sangon Biotech有限公司进行测序分析，结果显示13个噬菌体克隆中包含6个不同的氨基酸序列，其中DNA序列为CGCACCCGCCTGCA TACCCGC的噬菌体（P5，P9，P17，P34，P46）被富集，其相应的氨基酸序列为RTRLHTR。

图1 比较选择的噬菌体克隆在异位内膜与在位内膜的不同

2.4 噬菌体竞争抑制实验 预先用合成多肽RTRLHTR处理后，相应噬菌体克隆P5与子宫内膜异位症细胞的结合能力呈多肽剂量依赖性降低。相反，对照组多肽没有显示这种特异性结合活性。多肽RTRLHTR在不同浓度（0、0.1、1、10、100及1000 nmol/L）其OD450值分别为0.64±0.04，0.59±0.05，0.54±0.03，0.46±0.05，0.38±0.02及0.29±0.03。多肽RTRLHTR浓度在1000 nmol/L时能抑制50%的结合活性。多肽RTRLHTR浓度≥10 nmol/L时，结合活性与对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05），而多肽RTRLHTR为低浓度（0、0.1、1 nmol/L）时，与对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见图2。

表113个克隆的DNA序列

图2 不同浓度的合成多肽-噬菌体竞争抑制表现情况

3 讨论

子宫内膜异位症在形态学上呈良性疾病表现，但在临床行为学上具有与恶性肿瘤类似的特点。手术治疗是子宫内膜异位症治疗中较为有效的手段[4]，然而其有不利的一面，常导致卵巢皮质的丢失，卵巢功能的损害，以及较高的复发率。药物治疗中GnRH-a是治疗子宫内膜异位症的最有效的药物[5]。然而药物的作用是暂时的、保守性的、或是术前处理用的[6]，还伴随明显的不良反应，这些都降低了患者的依从性。究其原因主要是这些激素治疗不能选择性地作用于异位内膜细胞。

肿瘤靶向治疗是将高度特异性的亲肿瘤物质作为载体，使其携带抗肿瘤药物特异性对肿瘤部位进行靶向药物治疗，成为肿瘤治疗的新途径[7-8]。小分子多肽是一种理想的抗肿瘤靶向药物的载体，其结构简单，容易制备，且对肿瘤组织穿透力强，无免疫原性等优点[9]。而噬菌体展示技术被认为是筛选肿瘤细胞表面特异性结合肽的强有力、高通量的一种生物学技术，能够快速筛选出与靶分子亲和力高的配体，其最大的优势即实现了基因型和表型的结合[10]。这为研究子宫内膜异位症的发生发展、诊断及治疗提供新的方法。目前以肿瘤细胞为靶标，应用噬菌体展示技术在体外已成功筛选到能与不同肿瘤细胞如子宫内膜癌、卵巢癌、宫颈癌等细胞表面特异性结合的多肽[11-12]。国外也有学者曾报道过子宫内膜异位症的特异性结合肽的筛选[13]，国内尚无研究子宫内膜异位症的特异性结合多肽的筛选的文献报道。

本研究中，在采用噬菌体展示技术的基础上联合应用体外快速差减筛选技术，筛选特异性结合到子宫内膜异位症细胞的多肽，能有效减少非特异性结合，提高筛选效率[14]。我们经过5轮的差减筛选，噬菌体浓度从0.9±0.2到26.9±1.9，第5轮中生物淘洗的浓度是第1轮中的30倍，提示结合的噬菌体被富集了。然后经过5轮差减筛选的50个蓝斑被随机选取，用于ELISA试验及DNA测序，结果显示有13个噬菌体包含6个氨基酸序列，其中DNA序列为CGCACCCGCCTGCATACCCGC的噬菌体被富集，其相应的氨基酸序列为RTRLHTR，这提示了插入序列所编码的多肽可能具有子宫内膜异位症靶向性的潜能。通过DNA测序结果发现序列RTRLHTR最具有潜在研究价值，为了验证脱离了噬菌体衣壳蛋白的多肽是否仍具有子宫内膜异位症细胞特异亲和力，以及多肽与其对应的噬菌体是否竞争结合于同一结合位点，进行了噬菌体竞争抑制实验。化学合成多肽RTRLHTR后进行噬菌体竞争抑制实验，结果表明预先用合成多肽RTRLHTR处理后，相应噬菌体克隆P5与子宫内膜异位症细胞的结合能力呈多肽剂量依赖性降低，说明脱离了噬菌体的多肽仍具有子宫内膜异位症细胞特异亲和力，进一步表明其为子宫内膜异位症细胞表面的特异性结合肽。

综上所述，我们利用噬菌体展示技术筛选并鉴定了一个新型多肽序列RTRLHTR，该多肽对子宫内膜异位症细胞有高亲和力，为药物靶向传递至这些异位内膜细胞提供候选。这个多肽技术能被用于连接到包含脂质体的激素治疗，同样能改善激素对子宫内膜异位症治疗作用的特异性和有效性，对子宫内膜异位症相关激素治疗疗效的改善都有一定的作用，既能导致异位内膜细胞生长的抑制而又没有全身的不良反应。可能为子宫内膜异位症的早期诊断、复发及治疗提供新的方向，本研究标本数量有限，要进一步明确特异性结合肽与子宫内膜异位症的相关性并推广至临床尚需增大样本量的研究。另外仍有较多问题需要进一步的研究，包括亲和力的改善，药代动力学的研究，以及多肽在活体动物上干预的应用等。