日本无刺花椒风味物质的分析研究

何祖新，祝磊，黎江华，彭伟，魏大能，吴纯洁*

(1.四川得恩德药业有限公司，四川 绵阳 621100；2.成都中医药大学 药学院，成都 611137)

花椒系芸香科花椒属植物，因其独特的“麻辣鲜香”被用来作为食品调味料，也被誉为中国“八大味”之一，在川渝地区更是麻辣味川菜、凉菜及火锅中必不可少的调味品。花椒主要包括红花椒(ZanthoxylumbungeanumMaxim.)、青花椒(ZanthoxylumschinifoliumSieb. Et Zucc.)和竹叶椒(ZanthoxylumarmatumDC.)[1]，主要的商品有红花椒、青花椒、藤椒等。花椒既是香料，也是药用经济作物。近年来，各地在农业产业结构调整、新一轮退耕还林及脱贫攻坚等实施过程中，将花椒作为主要经济作物之一，其种植面积与产量得以迅速增加，并形成了以陕西(韩城)、甘肃(武都)、山东(泰安)、四川(汉源、金阳、茂汶、三台、洪雅等)、重庆(江津)、云南(昭通)等省市为核心区域的全国闻名花椒基地[2]。四川作为花椒的重要产区，已出台相关扶持政策，明确到2020年打造成为全国“花椒产业第一省”[3]。

目前，四川省栽培的“汉源花椒”、“大红袍”、“九叶青花椒”、“藤椒”等知名品种均为传统品种，枝条有较多的刺，采摘用工多，还经常刺伤手指，制约了规模化发展[4]。日本无刺花椒的果皮、青果、嫩芽、种子等具有重要的应用价值，并因无刺或少刺，采摘方便，较国内花椒能节约大量管理用工，极具生产栽培价值[5,6]。1994年开始，日本金村医药株式会社有关专家开始在国内深圳、四川、河南、河北分别试栽日本花椒(山椒)，但嫁接成活率不高[7]。其后，河北、四川、贵州等省林科院及甘肃陇南市农科所等科研院所对日本无刺花椒引进和培育做了大量研究工作，也培育出部分自己的无刺品种[8]。日本无刺花椒的开发利用已成为目前研究的重点，但主要集中在其品种选择、苗木快繁培育、栽培、经营管理、病虫害防治等方面，而对于其“香”、“麻”的重要评价指标(风味特征)的研究较少。因此，本文采用HS-SPME-GC-MS和HPLC技术分别对日本无刺花椒的香味物质和麻味物质进行定性、定量分析，以期为后续日本无刺花椒的开发利用、质量标准及品质评价提供参考，并为四川花椒产业的发展提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

成熟期日本无刺花椒：来源于四川省引种栽培的日本无刺花椒(朝仓山椒)，由广元市昭化区太公镇日本无刺花椒种植基地提供。

羟基-α-山椒素对照品、羟基-β-山椒素对照品、羟基-γ-山椒素对照品：自制，纯度均大于98%；甲醇(分析纯)：成都科龙试剂厂；甲醇(色谱纯)、乙腈(色谱纯)：美国Sigma-Aldrich公司；水为自制去离子水。

1.2 仪器与设备

GC-MS-TQ8040气相色谱-质谱联用仪、LC-20A高效液相色谱仪 日本岛津公司；固相微萃取仪、HP-1510顶空萃取器、100 μm PDMS萃取头 美国Supelco公司；Rxi-624Sil MS毛细管柱 美国Restek公司；电子天平 德国赛多利斯公司；中药粉碎机 浙江省永康市溪岸五金药具厂；超声波清洗器 天津奥特赛恩斯仪器有限公司；超纯水器 成都超纯科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 样品预处理

将日本无刺花椒置于烘箱中，40 ℃低温干燥，筛去椒目，将干燥果皮粉碎后过50目筛，备用。

1.3.2 香味物质分析[9,10]

1.3.2.1 样品萃取与脱附

称取日本无刺花椒(0.3 g)，置于萃取瓶中；230 ℃下活化萃取头(3 min)，将萃取头插入萃取瓶中，50 ℃下萃取30 min；再将萃取头插入气相色谱仪的进样口，230 ℃下脱附3 min。

1.3.2.2 气相色谱-质谱条件

采用HP-5(0.25 mm×30 m，0.25 μm)石英毛细管柱。升温程序：起始柱温50 ℃，保持2 min，以4 ℃/min上升至200 ℃，保持5 min；15 ℃/min上升至240 ℃，保持5 min。载气为高纯度氮(N2)，柱前压53 kPa，分流比36∶1。进样口和接口温度均为230 ℃；电子轰击EI离子源，电子能量70 eV；扫描范围(m/z)50～550，全扫描模式进行采集。

1.3.2.3 定性分析

香味物质的定性分析由质谱仪所带数据包(Wiley Library ver. 9、NIST Library ver. 14和 NIST Library ver. 14s)进行自动检索与匹配。本实验中，仅统计匹配度大于90的香味物质，确保数据的严谨性。香味物质的定量分析则采用峰面积归一化法。

1.3.3 麻味物质分析[11-13]

1.3.3.1 样品制备

取日本无刺花椒0.5 g，精密加入甲醇50 mL，称定重量，超声处理(功率240 W，频率40 kHz)30 min，冷却至室温，再次称定重量，以甲醇来补足超声过程中减失的重量，摇匀，分析前采用微孔滤膜(0.45 μm)过滤，取续滤液，即得。

1.3.3.2 液相色谱条件

PHENOMENEX C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相：乙腈-水(40∶60)，柱温30 ℃，流速1.0 mL/min，检测波长270 nm，进样量10 μL。

1.3.3.3 定量分析

以自制的羟基-α-山椒素、羟基-β-山椒素和羟基-γ-山椒素作为对照品，配制成系列不同浓度的混合对照溶液。经麻味物质定量测定方法学考察后，采用高效液相色谱法进行检测。

2 结果与分析

2.1 香味物质的定性分析

按上述实验条件进行实验，日本无刺花椒香味物质总离子图见图1，GC-MS分析结果见表1。

图1 日本无刺花椒香味物质总离子图Fig.1 Total ion current chromatogram of aroma components of Japanese pepper

表1 日本无刺花椒香味物质的化学成分Table 1 The chemical composition of aroma components of Japanese pepper

续 表

由图1和表1可知，通过对日本无刺花椒的挥发性成分进行GC-MS分析，共鉴定了21个化合物，占香味化合物总量的99.55%，可反映日本无刺花椒香味化合物组分的大致情况。主要含有烯烃类化合物13个、酯类化合物6个、醛类化合物1个和醇类化合物1个，分别占香味化合物含量的89.31%，2.83%，5.46%，1.95%。根据红花椒(ZanthoxylumbungeanumMaxim.)的GC-MS分析结果和文献报道[14]，红花椒中主要含有烯类、醇类、酮类、醛类、酯类等挥发性成分，以柠檬烯含量最高，乙酸芳樟酯含量次之；相比于红花椒，日本无刺花椒则以柠檬烯含量最高，小茴香烯含量次之，说明小茴香烯可以作为日本无刺花椒区别于红花椒的香味化合物。

2.2 麻味物质的定量分析

2.2.1 色谱行为

在选定的条件下，3个麻味物质的色谱峰均达到基线分离，分离度与柱效均良好，混合对照品和样品的HPLC图见图2。

图2 混合对照品(A)、样品(B)的HPLC图Fig.2 HPLC chromatograms of mixed standards (A) and sample (B)

2.2.2 线性关系考察

分别称取羟基-α-山椒素、羟基-β-山椒素和羟基-γ-山椒素对照品适量，精密称定，置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，配制成含羟基-α-山椒素0.8 mg/mL、羟基-β-山椒素0.032 mg/mL和羟基-γ-山椒素0.028 mg/mL的对照品溶液，备用。精密吸取对照品储备液配制成系列不同质量浓度的混合标准溶液。分别进样分析3次，并以峰面积为纵坐标(Y)，质量浓度(μg/mL)为横坐标(X)进行回归，得到不同对照品的标准曲线。结果表明，各麻味物质在各自范围内呈良好的线性关系，见表2。

表2 回归方程、线性范围及相关系数Table 2 Regression equations, liner ranges, and correlation coefficients

2.2.3 精密度试验

精密吸取混合对照品溶液(10 μL)，按“1.3.3.2”项下色谱条件连续进样分析6次，测定峰面积，结果各成分峰面积的RSD分别是羟基-α-山椒素1.24%，羟基-β-山椒素1.32%，羟基-γ-山椒素1.45%，表明仪器精密度良好。

2.2.4 稳定性试验

精密吸取供试品溶液，按照“1.3.3.2”项下色谱条件，分别于0，4，8，12，18，24 h进样测定，测得各成分峰面积RSD分别是羟基-α-山椒素1.01%、羟基-β-山椒素1.35%、羟基-γ-山椒素1.89%，表明提取液在24 h内基本稳定。

2.2.5 重复性试验

精密称取6份日本无刺花椒(每份0.5 g)，按“1.3.3.1”项下方法制备供试品溶液，按照“1.3.3.2”项下色谱条件进行测定分析，结果各成分质量分数的RSD分别为羟基-α-山椒素0.97%，羟基-β-山椒素1.31%，羟基-γ-山椒素1.16%，表明该方法的重复性良好。

2.2.6 加样回收率试验

精密称取6份日本无刺花椒(每份0.25 g)，加入混合对照品适量，按“1.3.3.1”项下方法制备供试品溶液，计算各成分的平均回收率。结果表明，羟基-α-山椒素、羟基-β-山椒素、羟基-γ山椒素的平均加样回收率分别为101.23%，98.52%，97.67%；RSD值分别为1.35%，1.58%，2.05%，表明加样回收结果良好。

2.2.7 含有量测定

精密称取3份日本无刺花椒(每份0.5 g)，按照上述方法进行分析测定，并计算各成分含有量。结果表明，日本无刺花椒中主要含有羟基-α-山椒素，其含量分别是羟基-γ-山椒素和羟基-β-山椒素含量的21，28倍，见表3。

表3 含有量测定结果Table 3 The determination results of content mg/g

3 结论

本文对日本无刺花椒的香味物质和麻味物质进行了定性、定量分析，其中，HS-SPME-GC-MS联用技术可准确分析日本无刺花椒的香味物质，有效分离鉴定出21种化合物，主要为烯烃类、酯类、醛类及醇类化合物，并以柠檬烯含量最高，小茴香烯含量次之，2种成分合计占日本无刺花椒香味物质的66.9%，且小茴香烯也是区别于红花椒的香味化合物。本文成功建立了日本无刺花椒中麻味物质的HPLC分析方法，由混合对照品与样品的HPLC图可知，各成分分离效果较理想，适合于麻味物质的定量分析；含量测定结果表明，日本无刺花椒主要含有羟基-α-山椒素、羟基-β-山椒素及羟基-γ-山椒素，又以羟基-α-山椒素的含量最高，其含量分别是羟基-γ-山椒素和羟基-β-山椒素含量的21，28倍。本研究分析了日本无刺花椒的香味物质和麻味物质，可为日本无刺花椒的开发利用、质量标准及品质评价提供借鉴，并为四川花椒产业的发展提供理论依据。