去势小鼠椎体骨质疏松和终板重塑导致椎间盘退变

肖志锋 林定坤,* 何剑波 苏国义 侯宇 陈树东

1. 广州中医药大学-岭南医学研究中心中医骨伤科实验室，广东 广州 510405 2. 广东省中医院，广东 广州 510120

腰痛和神经放射性疼痛是椎间盘退变(intervertebral disc degeneration，IVDD)的主要临床症状[1-2]，严重的IVDD常导致脊柱不稳或残疾，给人类带来巨大的痛苦和沉重的社会经济负担[3]。然而，目前还没有有效的方法来修复退变的椎间盘，进一步明确IVDD的关键病理机制和开发有效的治疗药物仍是急需解决的问题。

终板是椎体和椎间盘锚定的过渡结构，是椎体与椎间盘联系的桥梁，椎间盘营养的供给主要通过上、下终板从椎体中获取[4-6]。在循环压力载荷下终板的液体流动是椎间盘摄取营养和排泄废物的主要方式[7-8]。椎体骨质疏松(osteoporosis，OP)时骨髓的微环境改变和终板骨化导致的骨髓运输通道阻塞减少可能会诱使和加重IVDD。有证据表明OP参与IVDD过程，绝经后妇女椎体OP与其发生IVDD相关[9-10]，同时荷尔蒙水平可以影响IVDD的严重程度[10-12]。然而一部分研究显示OP可以增加终板的渗透性从而延缓IVDD，二者是负相关的[8,13-14]。因此，椎体OP是否直接影响IVDD，椎体代谢如何影响到椎间盘仍不明确。本研究通过评估OVX小鼠的脊柱微病变，包括椎体、终板及椎间盘，进一步明确绝经后椎体OP是否可导致IVDD以及其作用机制。

1 材料和方法

1.1 实验动物和实验设计

30只8周龄SPF级健康C57BL/6 J雌性小鼠，购于广州中医药大学实验动物中心[SCXK (粤) 2013-0034]，饲养于22 ℃～25 ℃，40%～60%相对湿度环境下，昼夜交替，自由饮食。适应性饲养3 d后小鼠随机分为CT组(Control组)和OVX组(OVX组)，每组15只。两组分别行假手术和双侧卵巢摘除，之后每周记录小鼠的体重变化。造模12周后处死小鼠，获取L4/5脊柱节段用于后续实验。本实验通过广州中医药大学实验动物中心伦理委员会伦理审查，按照实验动物使用和关怀指导原则进行。

1.2 Micro-CT分析

获取L4/5脊柱节段，立即浸入4%多聚甲醛溶液中4 ℃固定72 h，样本用PBS冲洗3次，每次15 min，待测。根据Bian等[15]报道的方法，脊柱样本(n=6)用于高分辨率Micro CT扫描(Skyscan1172)。简要过程如下：扫描参数设定为电压59 kv，电流100 μA，层厚9 μm；扫描图片分别使用NRecon v1.6软件和CTAn v1.9软件进行重建和分析，使用CTvox v3.0软件进行三维图像重建。L4/5的冠状面三维图像用于终板及椎间盘的形态分析。应用CTAn v1.9软件定义椎体、终板、椎间盘的感兴趣区，200层连续感兴趣区于椎体的三维重建，椎间盘感兴趣区定义为L4/5椎体间不可见区域。终板定义为覆盖在椎体表面的可见骨性结构。

1.3 组织病理学和免疫组织化学检测

L4/5节段脊柱(n=9)浸入10%的中性EDTA(PH=7.4)溶液中常温脱钙14 d，流水冲洗4 h后，梯度脱水并石蜡包埋，样本进行4 μm冠状面切片，之后进行番红O-固绿染色以及免疫组织化学染色。番红O-固绿染色根据说明书操作(赛维尔公司，武汉)，免疫组织化学染色根据Abcam/Santa Cruz 标准操作流程进行。简要过程如下：切片脱蜡，水化，EDTA(PH=8.0)抗原修复液中微波加热至沸腾20 min，冷却至室温，3%H2O2处理10 min 阻断内源性过氧化物酶，山羊血清封闭常温封闭15 min，一抗 Col2 (Abcam，ab34712，1∶200)，血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)(Santa Cruz，sc-7269，1∶200) 4 ℃孵育过夜。阴性对照组用PBS孵育。免疫组化步骤根据北京中杉金桥公司PV-6001免疫组化二步法操作流程进行，DAB显色后，苏木素复染细胞核15 s，黄棕色代表阳性。免疫荧光实验，切片避光孵育Alexa Fluor®555标记荧光二抗(CST Corporation，USA，#4409) 1 h，DAPI染核10 min，利用显微镜进行观察和拍照(Olympus DP80，Japan)。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 OVX小鼠的大体观，子宫形态、重量及体重变化

大体观显示OVX组小鼠腹腔内可见大量脂肪堆积(图1 A，空心箭头)；实验结果显示，CT组和OVX组小鼠体重随时间不断增加，而OVX组体重增加较CT组更为明显(图1 B)。同时出现明显的子宫萎缩，重量减轻，与CT组相比，差异具有统计学意义(*P<0.05)(图1C、D)。

图1 OVX对小鼠体重及子宫的影响。A、B：小鼠大体形态和重量(空心箭头指示腹腔脂肪堆积)；C、D：子宫形态和重量

2.2 OVX小鼠L4/5脊柱节段椎体、终板微结构及椎间盘体积变化

Micro-CT结果显示OVX组小鼠骨小梁明显稀疏、变细(图2 A)，骨小梁结构参数显示OVX组小鼠L4椎体骨体积分数(BV/TV)、骨小梁数量(Tb.N)以及骨小梁连接密度(Conn.Dn)与CT组相比明显降低(*P<0.05)，而骨小梁变异系数(Tb.pf)及模型指数(structure model index，SMI)明显升高(*P<0.05)，差异有统计学意义。骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁间距(Tb.sp)及开放性孔隙率[Po(op)]两组间差异无统计学意义，但OVX组小鼠骨小梁在Tb.sp 和 Po(op)上有上升趋势(图2)。同时，OVX组小鼠终板中出现明显骨化重塑，终板表面孔隙增加(图3，箭)，伴随着椎间盘间隙变窄，体积减少，与CT组相比差异具有统计学意义(*P<0.05)，(图3)。

图2 OVX对小鼠骨微结构和参数的影响。A：骨微结构；B：孔隙率；C：骨体积百分比；D：骨小梁数量；E：骨小梁厚度；F：骨小梁间距；G：骨小梁变异系数；H：骨小梁连接密度；I：模型指数

2.3 OVX小鼠椎间盘的病理改变

病理结果显示CT组椎间盘形态结构正常，椎间盘髓核组织中大量脊索细胞被大量细胞外基质包绕，终板为大量软骨细胞组成的透明软骨(图4 A、C)。OVX组小鼠出现明显的IVDD，可见髓核减少、基质降解和形态结构紊乱(图4B，箭头)；番红O-固绿染色可见终板被染成与骨组织相同的深绿色，表明蛋白多糖丢失(图4B)；可见终板骨化和增厚，出现髓腔(图4D，双向箭头)，软骨潮线不断上移(图4D，箭头)及表面靠近髓核的软骨终板不断变薄、活性细胞不断减少(图4D)。

2.4 OVX小鼠椎间盘中Col2、VEGF的表达

免疫组织化学结果显示，与CT组相比，OVX组小鼠椎间盘中Col2表达明显降低，尤其在终板骨化重塑区和外层纤维环丢失明显(图5，箭头)。免疫荧光显示VEGF在OVX小鼠椎间盘终板中显著升高(图6，箭头)，有趣的是OVX小鼠终板中Col2降低的区域与VEGF升高的区域基本一致，这预示着二者是相互影响的致病因素，无血管椎间盘终板的骨化重塑和血管新生可能是IVDD的重要环节。

图3 OVX对终板结构及椎间盘体积的影响(箭头示终板孔隙及微结构改变)

图4 OVX小鼠椎间盘的番红O-固绿染色。A：CT组小鼠椎间盘形态结构基本正常；B：OVX组小鼠椎间盘可见明显退变，形态结构紊乱，终板明显骨化增厚；C和D：终板局部高倍放大图

图5 OVX小鼠椎间盘中Col2的表达。A、B：终板；C、D：髓核；E、F：纤维环。箭头指示终板和纤维环中Col2表达显著降低

图6 OVX小鼠椎间盘VEGF的表达(箭头指示VEGF表达)

3 讨论

OP和IVDD是最为常见的脊柱退行性疾病，临床上它们常相互伴随，然而它们间的相互关系却不明确。本研究显示小鼠卵巢切除可导致椎体OP、终板骨化重塑和肥大、孔隙增加，从而导致IVDD。终板中Col2表达降低伴随VEGF表达明显升高，表明异常的终板骨化和血管新生参与OP介导的IVDD过程。

既往研究显示，年龄、性别、肥胖、遗传、免疫、营养、炎症、机械力、损伤等多种因素均参与IVDD进程[14，16]。然而不论何种因素，IVDD是一个脊柱功能单位(包括相邻的结构如椎体、终板、韧带等)退变的过程[5-6，11]。椎间盘作为无血管组织，其代谢和力学主要受椎体及终板的影响，因此椎体及终板病变(如OP)可能是诱发椎间盘缓慢发生退变的起始因素。一些研究显示椎体OP时牵张应力的改变与多节段IVDD增高的许莫氏结节发生率相关[17]。此外，磁共振成像椎体终板下骨信号改变可以作为活动性IVDD的评判标准[18]。作为椎间盘与椎体间物质交换和生物力学传导的桥梁，终板的结构和功能完整是影响椎间盘的关键因素[19-20]，而终板界面结构的损坏可能是引起力学和生物因素恶性循环，推进IVDD进展的中心环节。一些研究发现，OP时终板的骨化重塑引起终板孔隙及渗透性降低而促进OP介导的IVDD过程[6]，相反另一些研究显示OP可以增加终板孔隙和渗透性延缓IVDD[8]，这些结论基于椎间盘主要依赖终板从椎体获取营养。然而本研究显示椎体OP、终板骨软骨重塑引起终板孔隙及渗透性增加促使了IVDD的发生，这可能与终板孔隙渗透增加导致抗原暴露、免疫炎症反应及椎间盘髓核内压逐渐丢失有关。有研究显示骨保护素基因敲除后OP小鼠椎间盘出现血管新生及炎症因子增加，预示着OP诱导了椎间盘的血管侵入和炎症反应[21]。此外，终板的Modic改变与腰痛关系密切[5，22]，伴随有终板Modic改变的人群IVDD更为严重。OP人群髓核更易于突入终板发生IVDD，终板损伤亦可造成正常的髓核内压不能维持进而导致蛋白多糖的降解丢失促使IVDD[23]，这些证据说明OP及终板损害是造成IVDD的不可或缺的因素。

Col2是软骨组织中含量最丰富的物质，它的含量对正常椎间盘功能尤为重要[24]，本研究结果显示OVX后小鼠椎间盘中Col2表达减弱，特别在终板骨化重塑区和外层纤维环。同时相应区域的VEGF显著上升，说明OP介导的终板骨化重塑、终板渗透性的增高和血管新生不是为椎间盘提供更多的营养，而是促使Col2的降解以及椎间盘的纤维化和退变。总之，本研究显示雌激素缺乏OP是造成IVDD的不利因素，椎体、终板结构的完整是椎间盘正常生理机能的保障。作为发挥“生物半透膜”功能的终板，只有完整的结构，合适的终板渗透性，才能在保证椎间盘正常的营养需求的同时又避免对椎间盘内微环境的干扰，以及维持髓核适当的渗透内压，确保椎间盘的代谢和功能。