生髓健骨胶囊对酒精性骨质疏松大鼠股骨生物力学影响的研究

任树军 梁彦林 任明辉 王墉琦 谭福柱 邢国利 姜益常

1. 黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨 150040 2. 黑龙江中医药大学研究生院，黑龙江 哈尔滨 150040 3. 西安市中医院，陕西 西安 710001 4. 黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040

酒精性骨质疏松[1-3](alcohol-induced osteoporosis，AOP)属继发性骨质疏松范畴，是指长期、大量饮酒导致骨矿含量、骨密度、骨量减少而致骨微观结构破坏及骨力学性能下降，引起骨折风险性增加的一种全身骨代谢性疾病。酒精滥用和酒精依赖导致骨坏死的发生率正逐渐增加，且缺乏具体量化标准，已成为众多国内外学者的研究方向[4]。自Saville在1965年发现过度饮酒者尸体标本的骨量显著降低后，众多学者在研究中证实过度饮酒主要通过改变[5]骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)、成骨细胞、破骨细胞等的增殖、分化，引起脂肪组织增多，造成骨组织形成减少等一系列病理生理变化。主要通过抑制成骨、促进骨吸收，导致骨质疏松最终形成[6-7]。

骨生物力学[8](biomechanics)是在生物力学理念上来分析人体在遭受创伤、各种病变以及手术后的力学特性，通过其理论对其生物学效应来指导临床骨折及软组织损伤的研究，促进了人体肌肉骨骼系统疾病在临床和基础研究上的进展，更加有效地对各种创伤、畸形、退变性疾病进行诊断和治疗，从而对骨生物力学有更深的认识，提高了临床疗效[9]。

本研究通过建立酒精性骨质疏松症大鼠模型，观察不同时期的酒精引起模型鼠股骨作用力的变化特征，探讨酒精在骨质疏松症形成过程中的作用机制，以研究生髓健骨胶囊对酒精性骨质疏松大鼠股骨生物力学的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物

黑龙江中医药大学动物实验中心提供清洁级雄性SD大鼠120只，动物合格证号：SCXK(黑)201701030，平均月龄约6个月，体重(220±20)g。按随机数字表法分为正常对照组、模型组、西药对照组、中药干预组4组，每组各30只，分笼喂养，适应性喂养1周后，称大鼠体重。

1.2 实验主要仪器及药物

1.2.1实验仪器：游标片尺(精确度0.02 mm，长150 mm)，北京仪器厂生产。电子万能试验机(AGS-10KNG型)，日本岛津公司生产。

1.2.2主要药物：生髓健骨胶囊(规格：0.35 g/粒)，黑龙江中医药大学附属第一医院，批准文号：黑卫药制字Z20110036；碳酸钙片[规格：500 mg/片(以钙计)]，吉林万通药业有限公司，批准文号：国药准字H10980201；阿法D3(规格：0.25 μg/粒)，以色列TEVA药厂生产，昆明贝克诺顿公司分装，批准文号：国药准字J20130162；白酒(规格：500 mL/瓶)，红星牌55度二锅头白酒，北京红星股份有限公司生产，生产许可证QS110015010349，批号：GB/T20822；生理盐水(规格：500 mL/袋)，四川太平洋药业有限公司，出厂批号：B1708018。

1.3 实验方法

健康清洁级雄性SD大鼠白酒灌胃法造模。按10 mL/(kg·d)[含纯酒精约4.4 g/(kg·d)]的剂量，每日灌胃1次，共持续16周。每周称体重1次，以调整白酒的用量。分别在8、12、16周时灌胃后禁食禁水12 h后采集标本，进行指标检测。

正常对照组：每日上下午用等量生理盐水灌胃2次。模型组：每日上午用白酒(按10 mL/kg的体重剂量)灌胃+等量生理盐水灌胃，每日各1次。西药对照组：每日上午白酒(按10 mL/kg的体重剂量)灌胃+碳酸钙片[按85 mg/(10 mL·kg)]和阿法D3[按0.05μg/(10 mL·kg)]以生理盐水配成混悬液灌胃给药(相当于成人等效剂量的10倍)，每日各1次。中药干预组：每日上午白酒(按10 mL/kg的体重剂量)灌胃+生髓健骨胶囊按4.7 g/(10 mL·kg)(相当成人等效剂量的10倍)以生理盐水配成混悬液灌胃给药，每日各1次。以上各组大鼠灌胃容积为10 mL/kg，灌胃给药时间共持续16周。实验期间各组大鼠自由进食和饮水，并给予全价标准营养颗粒饲料。每周称1次体重，根据体重调整用药剂量。

1.4 取材及检测方法

于干预造模后8、12、16周时，用颈椎脱位断髓法处死各组实验大鼠，立即剖出包括股骨头及股骨内外髁在内的完整左侧股骨，剔除残余结缔组织及肌肉，在生理盐水中冲洗并用生理盐水湿纱布包敷，用游标卡尺分别测出股骨中段外径，算出截面面积并用电子万能试验机进行股骨三点弯曲试验[10](加载点在股骨中段，支点跨距20 mm，加载速度2 mm/min)。计算骨生物力学指标为最大载荷、极限强度、最大挠度、弹性模量。

将制备好的股骨放置于电子万能试验机上，测量两支座间的距离，即跨距，确定加载点。放置好后调整试验机十字头的位置，使之于股骨完全接触的压力值为0，设定十字头运动加速度、试验机量程、原始位移等参数，进行实验。

1.5 统计学分析

所得实验数据用SPSS 19.0软件进行t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠体重变化情况

造模前各组大鼠体重差异无统计学意义(P>0.05)。造模后4周空白组与模型组相比较，空白组体重明显高于模型组(P<0.01)。用药8、12、16周后西药对照组、中药干预组与模型组相比，体重均明显升高(P<0.01)；西药对照组与中药干预组相比较，差异有统计学意义(P<0.05)，说明西药对照组体重明显低于中药干预组。见表1。

表1 各组大鼠体重变化比较

注：与正常对照组相比，★P<0.05，★★P<0.01，☆P>0.05；与模型组相比，▲P<0.05，▲▲P<0.01，△P>0.05；与西药对照组相比，●P<0.05，●●P<0.01，△P>0.05。

造模前各组体重相比较，差异无统计学意义(P>0.05)。造模后4周时正常对照组与模型组对比，正常组体重明显高于模型组(P<0.01)。与模型组相比，用药8、12、16周后西药对照组、中药干预组体重均明显升高(P<0.01)；西药对照组与中药干预组相比较，差异有统计学意义(P<0.05)，说明中药干预组体重明显高于西药对照组。

2.2 各组大鼠股骨结构力学性能比较(表2～4)

表2 用药8周时各组大鼠股骨结构力学性能比较

注：与正常对照组相比，★P<0.05，★★P<0.01，☆P>0.05；与模型组相比，▲P<0.05，▲▲P<0.01，△P>0.05；与西药对照组相比，●P<0.05，●●P<0.01，△P>0.05。

各组大鼠左侧股骨生物力学指标测定结果显示，模型组与空白组比较，大鼠股骨的最大载荷、极限强度、最大挠度、弹性模量均显著降低(P<0.01)。中药干预组和西药对照组均有不同程度的改善(P<0.05)。中药干预组最大载荷、极限强度、最大挠度均优于西药对照组，而弹性模量经比较差异无统计学意义(P>0.05)。

表3 用药12周时各组大鼠股骨结构力学性能比较

注：与正常对照组相比，★P<0.05，★★P<0.01，☆P>0.05；与模型组相比，▲P<0.05，▲▲P<0.01，△P>0.05；与西药对照组相比，●P<0.05，●●P<0.01，△P>0.05。

表4 用药16周时各组大鼠股骨结构力学性能比较

注：与正常对照组相比，★P<0.05，★★P<0.01，☆P>0.05；与模型组相比，▲P<0.05，▲▲P<0.01，△P>0.05；与西药对照组相比，●P<0.05，●●P<0.01，△P>0.05。

3 讨论

随着经济的发展，酒的消耗量也在增加。在各种社交中，饮酒往往是最常见的一种方式，而饮酒发生的悲痛教训值得我们重视[11]。酗酒主要抑制成骨细胞和BMSCs的增殖而促进其向成脂细胞的分化[5，12]。骨细胞内脂质沉积，打破了骨吸收和形成的动态平衡，从而使骨皮质变薄、骨小梁数量减少、骨髓腔增大、骨矿化障碍等一系列病理改变，导致骨生物力学的改变[13-16]。《素问·本神篇》云：“脾藏营，营舍意，脾气虚则四肢不用，五脏不安”，《素问·痿论》曰：“脾主身之肌肉”，肌肉丰满壮实乃骨骼强壮的力学保证[17-18]。骨生物力学常通过骨结构力学特征变化和内在质量来反映其抵抗破坏和变形能力的大小。现常用的骨生物力学试验是三点弯曲试验，主要测定骨组织对抗外力后的力学特征和生物学效应[19-20]。实验测定的指标包括最大载荷、最大挠度、弹性模量和极限强度，其中最大载荷直接反映骨小梁的骨质、结构的连续性、骨皮质的强度等，是对骨质量的综合反应；最大挠度可反映出骨小梁在垂直于轴线方向上的线位移，即最大变形长度；弹性模量为衡量股骨产生弹性变形难易程度的指标，其指越大，发生一定弹性变形的应力也越大，即刚度越大，亦即在一定应力作用下发生弹性变形越小；极限强度即导致骨折所需的应力[21-22]。上述指标主要反映出骨的结构力学特征的变化，它主要受到骨重建过程中几何形状变化的影响。

中医将骨质疏松症归于“骨痿”或“骨痹”的范畴[23]。中医理论方面认为，骨质疏松症的发生与脾肾密切相关，肾虚是其根本原因，脾虚是主要因素之一，两脏俱虚，可共同导致该病的发生[24]。《灵枢·经络》篇曰：“足少阴气绝，则骨枯……骨不濡则肉不能著也；骨肉不相亲则肉软却……发无泽者骨先死”。骨的生长、发育、强劲、衰弱与肾精盛衰关系密切，肾精为骨髓生化之源，骨骼得以滋养；肾精亏虚则骨骼失养而痿弱无力[25]。《素问·太阴阳明论》曰：“四肢皆享气于胃，而不得至经，必因于脾乃当得享也”。脾为后天之本，主运化，运化不力则脾精不足，肾精乏源，而致骨痿；脾气虚，津液不布，倦怠乏力，肌肉消瘦而致骨痿[26]。补肾健脾益气法是骨质疏松症治疗的重要法则[27]。前期研究表明，补肾健脾益气法能够提高酒精性骨质疏松大鼠骨密度和骨矿含量，抑制骨矿丢失[28]，同时又能够上调小肠组织内VDR mRNA的表达，提高对1,25-(OH)2D3的反应活性，促进肠钙、磷的吸收，促进骨形成，抑制骨丢失，有效改善骨代谢，提高骨质量，改善骨强度和硬度，提高骨生物力学指标[10]。生髓健骨胶囊针对“脾肾相关论”及对酒精性骨质疏松的病机特点，由《医学正传》里的鹿角丸化裁而来，方中龟板、鹿角胶补先天为君，补肾壮骨、填精生髓。鹿角胶益精血，偏补肾阳；龟板性补肾养阴，偏补肾阴，一阴一阳，二药合用，以达阴阳并补之功。《医经精义》曰：“精足则髓足，髓在骨内，髓足则骨强”。生黄芪、熟地、当归、白术培补后天为臣。生黄芪、熟地黄二药相伍，滋阴健脾，益气养血。黄芪、当归两药相合配伍，则气旺血生，阳生阴长。生黄芪、熟地、当归合用可助君药生补精血之功。白术健脾燥湿利水，可针对酒毒痰湿之疾。葛根、郁金、地龙、牛膝、丹参为佐药，牡蛎、龙骨合为使药，全方标本兼顾，配伍紧密，具有补肾生髓、健脾益气、健骨养阴、活血止痛之功效[29]。

本研究各组大鼠左侧股骨生物力学指标测定结果显示，模型组与空白组比较，大鼠股骨的最大载荷、极限强度、最大挠度、弹性模量均显著降低(P<0.01)，这说明大鼠在白酒灌胃后生物力学性能均下降。中药干预组和西药对照组均有不同程度改善(P<0.05)。中药干预组最大载荷、极限强度、最大挠度均优于西药对照组，而弹性模量经比较差异无统计学意义(P>0.05)，这可能在制备游离样本时破坏了骨小梁的边界结构连接。另外，如施加的压力与骨正常受力方向不一致，也会导致较小的弹性模量。这说明大鼠在白酒灌胃后随着骨质含量的逐渐下降，骨生物力学性能也不断下降。应用生髓健骨胶囊会使骨生物力学性能的各项指标，如最大载荷、极限强度、最大挠度、弹性模量明显改善，提高骨硬度和骨弹性，通过中西药对AOP大鼠的治疗作用进行对比分析，以期为骨质疏松发生过程中脾肾相关性研究提供实验依据，值得进一步运用现代分子生物学技术深入研究其作用机制及药理作用。