CKIP-1过表达对大鼠体外破骨细胞增殖影响的研究

2018-11-15杨依然刘钟王均华刘康史晓林

中国骨质疏松杂志 2018年10期

杨依然刘钟王均华刘康史晓林*

1. 浙江中医药大学，浙江杭州 310053 2. 浙江中医药大学附属第二医院，浙江杭州 310005

骨质疏松症(osteoporosis，OP)是一种系统性多因素骨骼疾病，其主要特征是骨量低，骨组织微结构损坏，骨脆性增加，继发骨折，并导致终身残疾或死亡[1]。成骨细胞主导的骨形成和破骨细胞主导的骨吸收共同组成的骨重建过程贯穿着生命体的始终，骨吸收大于骨形成而造成骨量减少的根源是由骨质疏松症发展的细胞水平决定的[2]。CKIP-1作为一种转录因子，是重要的成骨负调节因子[3]。CKIP-1沉默对体内、体外大鼠成骨细胞的细胞增殖和成骨分化都有明显的促进作用[4]，但是CKIP-1对体外破骨细胞的细胞增殖的影响至今尚且存在一定争议，相关报道也较少。尹秀山等[5]在建立CKIP-1基因敲除大鼠模型的过程中，诱导大鼠脾脏和骨髓中的单核/巨噬细胞细胞前体细胞向破骨细胞分化，进行相关检测发现CKIP-1可能不影响破骨细胞的功能。但在CKIP-1缺失情况下，骨髓中诱导出的破骨细胞数量比脾脏中诱导出的多，这提示CKIP-1可能对破骨细胞的增殖有影响。本研究取大鼠四肢长骨分离、培养破骨细胞，构建CKIP-1过表达慢病毒，通过观察CKIP-1过表达慢病毒感染的体外大鼠破骨细胞的增殖情况，探讨CKIP-1对体外大鼠破骨细胞增殖的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1实验试剂：DMEM培养基(Lifetechnologies，31966)，胎牛血清(Lifetechnologies，10099)，Antibiotic-Antimycotic(Lifetechnologies，15240-112)，PBS缓冲液(pH7.4)(Lifetechnologies，10010-049)，Trypsin-EDTA(0.05%)(Lifetechnologies，25300-054)，Lipofectamine & REG；2000 Transfection Reagent(Lifetechnologies，11668-019)，Opti-MEM & REG；I Reduced Serum Medium(Lifetechnologies，31985-062)，PureLink RNA Mini Kit(Ambion)，SuperScript & TRADE；III First-Strand Synthesis SuperMix for qRT-PCR(Invitrogen)，SYBR GreenER&TRADE；qPCR SuperMix Universal(Invitrogen)，碱性磷酸酶试剂盒(南京建成生物工程研究所，D001-2)，TRAP染色试剂盒(sigma-aldrich，NO387)，TRIZOL(全式金，H10318)，RNA溶解液(全式金，H10323)，DEPC(Amresco，E174)，氯仿(国药集团化学试剂有限公司，10006818)，CCK8试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司，C0037)，抗酒石酸酸性磷酸酶检测试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司，P0332)。

1.1.2实验仪器：CO2培养箱(Thermo，Thermo 3111)，超净工作台(苏信，YJ-840/YJ-1340)，MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate(ABI)，荧光定量PCR仪(Agilent，Stratagene MX3005p)，分光光度计(Beckman，DU730)显微镜(奥林巴斯，CX23)移液器(Eppendorff)，生物倒置显微镜(OLYMPUS，IX51)，台式低速离心机(上海贝恩生物科技有限公司，TDZ4B-WS)，振荡器(上海沪西分析仪器厂，WH-2)，离心机(Eppendorf，centrifuge 5415R)，PCR仪(Eppendorf，5333 53658)，低温冷冻离心机(上海卢湘仪离心机仪器有限公司，TG-16 M)，酶标仪(芬兰雷勃酶标仪，MK3)，移液枪(吉尔森P型移液器公司)，生化自动分析仪(Olympus Au 800)。

1.1.3实验动物：新生2 d龄SD乳大鼠5只。

1.2 实验方法

1.2.1大鼠原代破骨细胞的分离、培养、鉴定：取2 d龄SD乳大鼠5只，无菌取四肢长骨，放入含青、链霉素的冷D-Hank’s平衡盐溶液中，小心剥离肌肉组织，将软组织去除干净，洗2～3次，并将干骺段剪去，然后将骨置于5 mL含10%小牛血清的DMEM培养基，先横向剪成4～5 mm长的骨段，再纵向剪开暴露骨干内侧，用吸管反复吹打5～10 min。使贴附在骨基质上的破骨细胞脱落下来，收集含骨髓细胞的培养液，于35 mm培养皿中静置10 min，收集未贴壁的细胞悬液过200目细胞筛，以1 000 r/min离心10 min，弃去上清液，所得白色沉淀物即为制得的破骨细胞样细胞团。用含10%小牛血清的DMEM培养液重悬细胞，吹打均匀，将细胞悬液通过200目细胞筛。去除可能存在韵非破骨细胞和杂质成分。然后将滤过后的细悬液调成1×106/mL浓度，吹打均匀后，接种到培养瓶中，置于37 ℃，含5% CO2饱和湿度的培养箱内进行培养。12 h后换液，以去除红细胞和未贴壁细胞，每2日换液1次，生物倒置显微镜观察细胞形态并照相，抗酒石酸酸性磷酸酶染色试剂盒进行检测。

1.2.2病毒载体的构建和鉴定：(1)病毒载体的构建。合成美国国立生物技术信息中心 (National Center for Biotechnology Information，NCBI)中CKIP-1基因cDNA序列，结合酶切位点，构建至带GFP的过表达载体中。合成两端带有BamH I和Xho I酶切位点的上述序列，连接至pReceiver-Lv201载体。连接至pReceiver-Lv201载体，构建过表达载体pReceiver-Lv201-CKIP-1。(2)病毒载体的鉴定。照试剂说明书提取总RNA，总RNA抽提产物用反转录试剂盒进行反转录得到cDNA，进行荧光定量PCR。反应体系：SYBRGreenERqPCR SuperMix Universal：12.5 μL；Forward primer(10 μmol/L)：0.5 μL；Reverse primer(10 μmol/L)：0.5 μL；cDNA：0.5 μL；DEPC-treated water：11 μL。PCR扩增条件：50 ℃，2 min；95 ℃，10 min；40 cycles；95 ℃，15 s；60 ℃，60 s。按照仪器使用说明进行qPCR实验，收集数据，分析结果。

1.2.3慢病毒包装：(1)慢病毒构建。将293T细胞培养在含有10%FBS的DMEM完全培养基，37 ℃，5%CO2，饱和湿度环境。用胰酶消化处于对数生长期的细胞，用10%血清的培养基调整细胞密度为1.2 ×107细胞/20 mL，重新接种于15 cm的细胞培养皿。待细胞密度达70%～80%时将细胞培养基更换为无血清培养基。灭菌离心管中加入适量的目的基因载体以及病毒骨架载体，用Opti-MEM 混合均匀，调整总体积为2.5 mL，在室温下温育5 min。将Lipofectamine 2000 试剂轻柔摇匀，取100 μL与2.4 mL Opti-MEM 混合，在室温下温育5 min。把稀释后的DNA不稀释后的Lipofectamine 2000 进行混合，并在室温下温育20 min后将该混合液转移至293T细胞的培养液中，混匀，于37 ℃、5% CO2饱和湿度的细胞培养箱中培养。8 h后倒去含有转染混和物的培养基，更换为含有10% FBS的DMEM完全培养基，继续培养。(2)慢病毒浓缩。收集转染后48 h的293T细胞上清液。于4 ℃，4 000 g 离心10 min，将上清转移到0.45 μm超滤管中。过滤除去细胞碎片。以上清液于40 mL超速离心管中。4 000 g 离心15 min，浓缩病毒。将过滤管倒扣在样品收集管上，1 000 g离心2 min。将病毒浓缩液从样品收集管移出，分装后保存在病毒管中，-80 ℃保存备用。

1.2.4实验分组：将破骨细胞分为3组。A组：破骨细胞空白对照组；B组：破骨细胞+空载病毒组；C组：破骨细胞+CKIP-1过表达病毒组。取细胞经PBS缓冲液清洗3次后用0.25%胰蛋白酶+0.02% EDTA消化，待细胞解离后，用细胞培养基5 mL终止消化，吸管反复吹打，使细胞从培养皿底解离下来，然后放入15 mL离心管中，1 500 rpm离心5 min，用血球计数板计数细胞数量，然后按照1×105/孔细胞的数量，种植于6孔细胞培养皿中，过夜培养。次日，待细胞贴壁生长后，进行分组及对应处理。

1.2.5qRT-PCR检测：病毒感染48 h后，取以上处理后的细胞于无RNA酶的EP管中，加裂解液进行裂解；加入1 mL的Trizol，移入无RNA酶的EP管中，剧烈震荡5 min；加入氯仿200 μL，震荡直至乳化，再室温静置5 min。12 000 g 4 ℃离心15 min，从离心机中取出离心管，此时裂解液分为3层：无色的上清液、中间的白色蛋白层及带有颜色的下层有机相。吸取无色上清液转移至另一新的1.5 mL离心管中；经过异丙醇沉淀，乙醇清洗，沉淀溶解完成样本处理。

将RNA在65 ℃条件下水浴5 min后，立即置于冰上冷却。逆转录反应条件：37 ℃ 60 min；85 ℃ 5 min；4 ℃ 5 min；置于-20 ℃保存。反应体系(25 μL)：RNA-Primer Mix：12 μL，5×RT Reaction Buffer：5 μL，25 mmol/L dNTPs：1 μL，25 U/μL RNase Inhibitor：1 μL，200 U/μL M-MLV Rtase：1 μL，Oligo(dT)18∶1 μL，ddH2O(DNase-free)：4 μL。

采用两步法进行Real-time PCR。体系：Primer P1∶0.4 μL，Primer P2∶0.4 μL，2×supermix：10 μL，PASSIVE DYE：0.4 μL，Template：2 μL，ddH2O：6.8 μL，共20 μL。反应条件：95 ℃ 3 min，95 ℃ 30 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，40个循环。溶解曲线：95℃15 s，60 ℃ 15 s，20 min升温，95 ℃ 15 s。使用的引物序列：CKIP-F CGATCCCGCCATGAAGAAGA，CKIP-R TCAGCACCACATAGCGGTTT。

1.2.6CCK-8检验：在96孔板中接种细胞悬液(100 μL/孔)，将培养板放在培养箱中预培养一段时间(37 ℃，5% CO2)。待细胞完全贴壁后进行以上分组处理。向每孔加入10 μL CCK-8反应液。将培养板在培养箱内孵育2 h。用酶标仪测定在450 nm处的吸光度。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 大鼠原代破骨细胞抗酒石酸酸性磷酸酶染色鉴定结果

由图1可见，破骨细胞体积大，形状不规则，细胞核大小数目不一，呈圆形或椭圆形且排列无规则。抗酒石酸酸性磷酸酶染色鉴定显示分离获得的破骨细胞阳性率为(95.20±3.69)%。

图1 大鼠原代破骨细胞TRAP染色结果(图中比例尺为50 μm)

2.2 qRT-PCR检测破骨细胞中CKIP-1表达水平

由图2可见，在体外大鼠破骨细胞，A组和B组的CKIP-1基因表达水平差异无统计学意义；与A组和B组相比，感染CKIP-1过表达慢病毒的C组，CKIP-1基因表达水平明显显著提高(P<0.01)，这表明CKIP-1过表达慢病毒构建及感染体外大鼠破骨细胞均成功。

图2 qRT-PCR检测破骨细胞中CKIP-1的mRNA水平(**P<0.01)

2.3 CKIP-1过表达对破骨细胞增殖的影响(ckk-8检测)

图3结果显示，在破骨细胞中，A组和B组的细胞增殖水平差异无统计学意义。相比A组和B组，感染CKIP-1过表达病毒的C组的细胞增殖比例显著增高(P<0.01)，这表明在来自四肢长骨的体外大鼠破骨细胞，CKIP-1过表达可以明显提高破骨细胞的增殖能力。

图3 CCK-8检测各组细胞增殖情况(**P<0.01)

3 讨论

骨质疏松症是一种与增龄相关的骨骼疾病，随着人口老龄化的不断扩大，骨质疏松症已成为一个重要的公共卫生问题[6]，因此对骨平衡的生理调控机制和骨流失的病理机制的研究，和可能由此产生的新治疗策略变得非常重要[7]。CKIP-1作为重要的骨形成负调节因子，已经是对于OP治疗的有希望的靶标。Zhang等[8]使用去卵巢大鼠模型评估骨靶向递送系统(DSS 6-脂质体)递送的CKIP-1 siRNA的功效发现，治疗性CKIP-1siRNA干预可显著促进骨形成而不影响骨吸收。随后又有研究证明敲除CKIP-1基因可以抵消微重力造成的骨质疏松症[9]。Liu等[10]发现，成骨细胞靶向CKIP-1 siRNA治疗可以减弱糖皮质激素诱发的骨质疏松症小鼠的骨形成减少。

因为破骨细胞本身生命周期较短的原因，针对CKIP-1对破骨细胞影响的研究相对少很多。但是CKIP-1可以通过抑制TRAF6(TNF receptor associated factor 6)介导的蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)激活而在调节巨噬细胞稳态中起关键作用[11]，而单核/巨噬细胞和破骨细胞关系密切[12-13]。还有较新的研究证明破骨细胞增殖过程中出现的一种受体互动蛋白和成骨细胞的分化存在一定关系[14]，这对CKIP-1对破骨细胞的增殖影响机制的研究有一定提示意义。但也有文献报道，在敲入表达E3连接酶失活的TRAF6突变体的小鼠原代巨噬细胞和野生型细胞中，RANKL诱导的巨噬细胞信号传导和骨髓向破骨细胞的分化相似[15]。