ALDOB基因复合杂合变异致遗传性果糖不耐受饮食控制30年1例报告并文献复习

秦 谦 陈 乡 卢宇蓝 吴冰冰 王慧君 董欣然 杨 琳 周文浩,2,

遗传性果糖不耐受(HFI，MIM: 229600)是由于ALDOB基因变异导致的遗传代谢性疾病，呈常染色体隐性遗传。其主要表现为摄入果糖、蔗糖或山梨醇后出现低血糖、乳酸酸中毒、低血磷、高尿酸血症、高镁血症、高丙氨酸血症等代谢指标异常。临床发现主要为恶心、呕吐、腹痛、腹胀[1]。长期反复摄入含这些成分的食物可导致生长发育迟缓、智力障碍和肝肾功能异常，短期大量摄入者有较高的死亡风险。该病的发病率为1∶20 000至1∶30 000，在不同人种之间有一定差异，目前尚无中国人群发病率数据[2]。本文报告1例ALDOB基因复合杂合变异致HFI及30年随访结果，结合人类遗传变异数据库(HGMD)进行HFI疾病表型和基因型关联分析。

1 方法

1.1 病例报告 女，4岁，因“不明原因低热，呕吐后症状缓解”就诊。

既往史：患儿系G2P1，胎龄39周，出生体重3.5 kg。父母非近亲婚配，家族中无明确诊断的遗传病史。患儿生后20 d开始添加奶粉喂养，吃奶后立即出现呕吐，呕吐物为胃内容物，无黏液、脓血，呕吐后症状消失，发病过程中不伴有发热、反应差，大小便正常。多次因不明原因低热、呕吐后缓解就诊。后改为米粥喂养，呕吐症状缓解。婴幼儿期体型瘦弱，易哭闹，较难安抚。智力发育正常，运动能力发育迟缓。1岁开始说话，17月龄可以扶墙行走，23月龄仍独走不稳。

儿童期食西瓜、蛋糕等食物后约半小时出现呕吐症状，伴低热，呕吐后症状可缓解。家属开始自行停喂含糖类食物。7岁时曾以“吃甜食后半小时左右开始低热、饥饿感，呕吐后可缓解，面色不佳，体质较差，易感冒”主诉就诊上海某医院。当时体格检查：身高137 cm，体重17 kg，面色黄，体型瘦弱，反应正常，毛发正常，视力、心率、呼吸、四肢活动和肌张力未见异常。未行实验室检查。诊断“生长发育不良，遗传代谢性疾病待查”，嘱避免进甜食。

家属开始系统筛选和记录能引起患儿呕吐症状的水果、蔬菜和食物，家中做菜不添加食糖作料等。

目前随访至30岁，身高174.6 cm，体重57.6 kg，BMI 18.9 kg·m-2。智力发育正常，从事生物信息分析工作。心、肺、甲状腺、眼、耳、鼻、喉查体未见异常。腹部超声检查示肝区回声较密尚均，包膜光滑，肝内血管走形清晰，肝内胆管未见明显扩张；脾脏大小正常，回声分布尚均匀；胆道系统未见明显异常，胰腺形态正常，双肾回声分布尚可，形态、结构正常。血、尿常规、肝、肾功能未见异常。未行果糖负荷试验和肝组织醛缩酶B活性检测。

患者期望行基因检测明确遗传代谢性疾病待查诊断，在取得其父母知情同意下行全基因组序列检测。

1.2 基因检测 采集患者及其父母外周静脉血，行全基因组高通量测序(WGS)检查。血样抽提基因组DNA后，用超声仪将DNA随机打断成300～400 bp片段，磁珠纯化后产物经末端修复后进行接头连接、PCR扩增，形成测序文库，使用illumina测序仪测序(Pair End，片段长度150bp)。采用Qubit检测文库浓度，Agilent 2100 Bio analyzer检测文库片段长度和浓度。原始测序数据(fastq格式)首先采用FastQC[3]进行数据质量评估，给出基本统计信息、碱基质量分布、ATCG比例分布、GC含量分布、测序读长分布、重复水平评估和接头序列比例等数值；采用BWA[4]和GATK[5]算法推荐流程将原始数据比对到参考基因组(hg19)得到bam格式的文件，用GATK中部分模块对比对结果进行质量统计，包括比对率、PCR冗余度、测序深度等；采用GATK算法推荐流程从bam格式文件中进行变异获取，包含SNV(单核苷酸位点变异)、indel(小片段插入和缺失)、CNV(拷贝数变异)、SV(结构变异)和STR(串联重复序列)，同时对每种变异情况进行统计。在获取变异后，由复旦大学附属儿科医院(我院)内部生物信息小组开发的WGS自动分析系统进行后续分析。该系统首先对变异位点进行筛选、注释和分析[6]，包含了数据质控、位点位置筛选、公共人群频率筛查、本地人群频率筛查、疾病数据库(比如ClinVar[7]、OMIM[8])对变异进行注释、ANNOVAR[9]功能注释、疾病遗传模式的评估、分析公共数据库或者内部数据库既往报道情况等步骤，得到优选致病位点；同时用我院开发的临床表型自动匹配系统[10]自动采集患者表型并结构化为HPO[11]条目，再和优选位点进行匹配，得到符合临床表型的疑似致病位点，最终交由我院遗传咨询团队进行人工审核。父母外周血提取DNA，进行一代测序验证。

2 结果

2.1 基因检测结果 患者血液样本抽提DNA质量合格，CNV共计52个重复、114个缺失，SV共计1 526个易位、2 825个插入和431个倒位，这两类变异经过功能注释后未得到疑似致病变异，已知的三碱基串联重复序列相关疾病的碱基重复倍数均在正常范围之内。继续进行测序，得到467 894 022成对的测序片段，将序列比对到hg19共获取变异位点5 091 071个。通过我院WGS自动分析系统优选出31个重要位点(图1)，其中20个(65%)为错义变异，1个为移码突变。根据患者临床表型自动给出HPO条目HP:0005973(果糖不耐受，FI)，通过临床表型自动匹配可以得到其中2个疑似致病变异，提示患者携带ALDOB基因两个变异：①NM_000035, exon4:c.360_363delCAAA (p.N120Kfs*32)，②exon9:c.1013C>T(p.A338V)。Sanger验证显示，A338V来自父亲，N120Kfs*32来自母亲，为复合杂合变异(图2)。2个变异位点均为已报道的致病变异[12, 13]。

2.2 患者饮食谱的总结

2.2.1 不可食用 ①食物制作加工中添加糖、蜂蜜、木糖醇、阿斯巴甜、安赛蜜、玉米糖浆等；②药物类中，糖浆类、含甘草等成分中成药、含果糖、营养液等；③蔬菜类中，胡萝卜、甘薯、南瓜、甜玉米；④几乎所有水果。

2.2.2 少许食用 ①蔬菜类：洋葱、萝卜、苔薹、慈姑、莲藕、荸荠、卷心菜、甘蓝、西兰花、花椰菜、番茄、彩椒、黄瓜、丝瓜、西葫芦、冬瓜、茄子；②水果类：柚子、柠檬等酸性水果，牛油果；③作料：醋、蒸鱼豉油；④药物：含片类药物。

图1WGS分析流程图

注 1)：比对到hg19上且方向正确的reads占99.8%，PCR过程生成的reads占22.8%，双端都比对到hg19上的reads占97.6%，碱基覆盖度占全基因组碱基总长的99.2%，碱基覆盖度不低于20X的97.7%

图2Sanger验证结果原始图像

2.2.3 可食用 ①奶类、肉类、海鲜类、蛋类、谷物、坚果；②蔬菜类：莴笋、芦笋、竹笋、芋头、土豆、茭白、菱角、蕨菜、莴苣、大部分叶菜类、豆芽、豆苗、金针菜、芥蓝、辣椒、苦瓜、各种豆类、所有菌类；③葡萄糖、糊精、麦芽糖，大部分作料，胶囊类、片剂类药物、外用药物，无添加成分包的茶、咖啡、酒类(啤酒、干红、白酒)等。

2.3 表型、基因型关联分析 目前认为ALDOB基因的表型基因型关系不明确。本文总结了HGMD数据库收录为致病变异、同时有详细临床信息的33例HFI患者资料(表2)。按照是否控制饮食来分，在8例未控制饮食的患者中，6例(75%)预后不良(包括2例死亡、2例肝功能衰竭、1例肝功能异常、1例生长发育迟缓)，在2例预后尚可的患者中，携带的变异类型均为错义变异；在19例进行饮食控制的患者中(包括文献中18例及本文患者)，9例(47.4%)预后不良。在9例进行饮食控制但仍出现预后不良的患者中，变异位点中55.6%(10/18)为移码变异，5.6%(1/18)为剪接位点变异，38.9%(7/18)为错义变异；在10例进行饮食控制后未出现预后不良的患者中，变异位点中30%(6/20)为移码变异，25%(5/20)为剪接位点变异，45%(9/20)为错义变异。该结果提示：1)饮食控制者预后好于非饮食控制者；2)变异类型对患者预后有一定的预测作用，即携带移码变异的患者在饮食控制后仍有可能预后不良；3)未控制饮食下无严重不良预后的患者均携带错义变异，此类变异类型可能对蛋白质功能影响较小。该结论有待进一步的功能学研究证实。

表2 HGMD数据库收录为致病变异的同时有详细临床信息的33例遗传性果糖不耐受患者的资料

注 NA：未描述；het：杂合突变；hom：纯合突变

3 讨论

果糖代谢异常相关的单基因遗传病有果糖尿病(MIM: 229800)、 HFI(MIM: 229600)和果糖-1,6-双磷酸酶缺乏症(MIM: 229700)[1]。本文患者临床发现基本符合HFI疾病表型。WGS测序提示患者携带ALDOB基因的2个突变，NM_000035, exon4:c.360_363delCAAA (p.N120Kfs*32)和 exon9:c.1013C>T(p.A338V)，均为HGMD数据库[14]报道的已知致病变异。A338V来自患者父亲，N120Kfs*32来自患者母亲。A338V在1998年首次被Ali等[13, 15]报告，该位点见于欧洲人群，为罕见变异。N120Kfs*32首次于1990年被Dazzo等[12]报告，携带该变异的患者为39岁妇女，表现为进食甜食后出现腹痛、消化不良、易疲劳，临床发现与本文患者相似。本文患者未检测到KHK和FBP1基因的致病或疑似致病变异。综合临床发现、测序结果以及家系内验证结果，可明确诊断为HFI。近年来，随着遗传检测的费用下降，遗传检测已经取代侵入性的肝活检以评估醛缩酶B活性，成为HFI主要的诊断手段。

本文患者婴幼儿期怀疑HFI，虽然未行果糖负荷试验，家长有意识地系统筛选禁忌水果、蔬菜和食物，在逐步严格控制禁忌水果、蔬菜和食物的30年中，生长发育、智力发育和肝功能均得到了较好的保护，并为ALDOB基因突变的HFI果糖-1,6-二磷酸醛缩酶B功能缺陷导致果糖代谢疾病相关的代谢通路，提供了较为完备的可食用、可食用少许剂量和禁忌食谱。既往ALDOB基因的表型基因型关系并不明确，本文分析HGMD数据库收录为致病变异、同时有详细临床信息的33例患者加上本文1例，行表型基因型关联性分析发现，未控制饮食患者预后不良比例 [6/8例(75%)] 高于饮食控制患者[9/19例(42%)]。但是，在进行饮食控制的患者中，仍有50%预后不良，进一步分析变异类型，这些患者中移码变异占55.6%，高于控制饮食后未出现预后不良的患者(27.8%)。提示变异类型与患者预后有一定关联，携带移码变异的HFI患者在控制饮食的情况下仍可能预后不良，需要更为严格的饮食控制并密切随访。

果糖不耐受是不明原因慢性腹痛患儿的主要病因之一[16]，由于该疾病症状严重程度的异质性，实际患病率可能高于目前实际诊断。表2中例4既往临床症状较轻，因外科手术术中摄入50 g果糖、术后肠外营养含果糖，于手术后第6 d死亡[17]。提示对于不明原因呕吐、慢性腹痛患者，要予以重视，应考虑HFI可能。是否应该在健康人群或新生儿期进行相应的筛查，也值得进一步探讨。

HFI是由于果糖-1,6-二磷酸醛缩酶B的功能缺陷导致。果糖-1,6-二磷酸醛缩酶(EC 4.1.2.13)是一种四聚体催化酶，催化底物为果糖-1,6-二磷酸和果糖-1-磷酸，在脊椎动物中有3种同功醛缩酶ALDOA、ALDOB和ALDOC。3种酶C末端的同工酶特异性区域决定了其不同功能。ALDOB主要在肝脏和肾脏中表达，ALDOA主要在肌肉和红细胞中表达。果糖在肝脏中通过ALDOB催化参与糖异生，在肌肉脂肪组织中通过 ALDOA催化参与糖酵解。 ALDOB缺乏可导致果糖在肝、肠和肾脏中的不完全代谢，导致底物果糖-1-磷酸的积累，从而引起相应临床表型。ALDOB基因缺失的小鼠同样表现出果糖不耐受表型[18]。

目前，ALDOB基因的热点变异为A149P、A174D、N334K,、A337V、R303W和R59X。其中A149P、A174D和N334K是欧洲和北美人群的主要变异[19]。本文患者携带的变异均为非热点变异。在复旦儿科人群中(12 807例panel ,9995例WES)，A338V和N120Kfs*32的人群频率均为0.1%，且均为杂合携带者。复旦儿科人群数据库中，暂无其他携带ALDOB基因复合杂合变异患者的报道。仅有1例已知致病变异携带者(p.D219N)有肝脏和消化道功能异常的症状。Esposito等[18]发现杂合携带者在食用果糖后有轻微的低血糖反应，提示该基因存在半合剂量不全特征。